Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de disfunción visual en el mundo desarrollado. En ellas se produce la degeneración y muerte de las neuronas fotorreceptoras, originando una disminución o pérdida total de la visión, en los casos más severos. Las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo de células gliales en la retina, y las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) desempeñan un papel clave tanto en la prevención como en el progreso de estas enfermedades. En condiciones fisiológicas las CGM y las células del EPR son las encargadas del mantenimiento estructural, fisiológico y funcional de la retina. Ante alteraciones fisiológicas o frente a daños de diferentes tipos, las CGM y las células del EPR modifican levemente sus funciones a fin de restablecer las condiciones normales o reparar los daños existentes. La proliferación y la migración se activan como parte de una respuesta inespecífica, pero cuando el daño persiste por mecanismos aún desconocidos estos procesos se descontrolan y exacerban, tornándose contraproducentes. A su vez, la localización de estas células en lugares inadecuados distorsiona severamente la estructura y función de la retina, contribuyendo al desarrollo de la disfunción visual, particularmente en las patologías retinoproliferativas. Dilucidar los mecanismos de regulación de la proliferación y la migración, como así también las moléculas que intervienen, es clave para lograr un tratamiento integral de estas enfermedades. Los esfingolípidos bioactivos son moléculas señal que regulan una gran cantidad de procesos biológicos como la supervivencia, proliferación, migración e inflamación. Entre éstos, la ceramida-1-fosfato (C1P) es un esfingolípido que regula numerosas funciones biológicas en diferentes tipos de células. La C1P es generada por la acción de la ceramida quinasa (CerK), enzima encargada de sintetizar C1P a través de la fosforilación de la ceramida (Cer). La actividad de CerK es clave para la señalización celular mediada por C1P y está regulada por niveles bajos de Ca+2, fosforilación y diversos estímulos. La C1P promueve la proliferación través de la activación de diferentes vías de señalización intracelular y la inflamación mediante la unión y activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), que interviene en la síntesis de prostaglandinas. Para promover la migración, se ha propuesto que la C1P activa un receptor extracelular específico (parcialmente identificado). Trabajos previos de nuestro laboratorio demuestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo muy relacionado a la C1P, promueve la migración de las CGM (Simón et al. 2015). Dada la estrecha interacción metabólica y funcional entre los esfingolípidos, es de gran interés establecer si la C1P, cuyas funciones son semejantes a las de S1P, interviene en la regulación de los procesos que contribuyen a las patologías retinoproliferativas. El objetivo de esta Tesis es investigar si la C1P y la CerK participan en la migración y en la proliferación de las CGM y las células del EPR. Mediante el ensayo de la herida y utilizando cultivos gliales puros de retina de rata y la línea celular humana de EPR, ARPE-19 investigamos los posibles efectos de C1P/CerK en la migración de estos dos tipos celulares. En estos ensayos de motilidad celular, consideramos la reducción del ancho de la herida como un indicador de la migración. Al evaluar el efecto de C1P sobre la migración de las CGM, determinamos que la C1P aumentó la migración a través de la reorganización del citoesqueleto de actina y la formación de filopodios y lamelipodios. Mediante ensayos de incorporación del nucleótido Bromo-deoxiuridina (BrdU) establecimos que la migración no contribuyó al cierre de la herida. Luego investigamos las vías de señalización involucradas en el efecto de C1P. La inhibición de las vías PI3K/Akt y JNK con LY294002 y SP600125, respectivamente, disminuyó la migración glial, tanto en los controles como en los cultivos tratados con C1P. Mediante ensayos de Western blot comprobamos que el agregado de C1P aumentó los niveles de p-Akt, forma activa de la Akt, respecto a los controles, confirmando la activación de la vía de la PI3K. Al inhibir la vía de ERK / MAPK con el inhibidor U0126 disminuyó la migración promovida por la C1P, pero no se alteró la migración en los controles. A continuación, evaluamos el papel de la cPLA2, mediador de C1P en la inflamación, que es activada por su unión a C1P. El tratamiento con ATK, un inhibidor de cPLA2, redujo notablemente la migración glial en cultivos tratados con C1P, mientras que en los cultivos controles la migración no fue alterada. Demostramos así que la C1P promueve la migración de las CGM mediante la activación de cPLA2 y JNK, PI3K y ERK / MAPK. Además, el agregado conjunto de C1P y S1P, evidenció que estos esfingolípidos tuvieron juntos el mismo efecto promotor de la migración glial que cuando fueron suplementados por separado, evidenciando una interrelación entre ellos en la regulación de los mecanismos que activan río abajo. Como la realización de la herida activó la migración celular, decidimos evaluar si la síntesis endógena de C1P estaba involucrada en dicha migración. Para ello, establecimos en primer término, mediante RT-PCR que las CGM expresaban CerK. Incubando los cultivos gliales con NVP231, un inhibidor de la CerK, demostramos que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración glial en los controles y para la estimulación de la migración por C1P. Para descartar que la inhibición de la motilidad reflejara una pérdida de viabilidad celular, evaluamos dicha viabilidad por ensayo de MTT. Determinamos que el tratamiento de los cultivos gliales con NVP231 no alteró la viabilidad celular. En las células del EPR el tratamiento con C1P aumentó la migración, mediante la reorganización del citoesqueleto de actina y el desarrollo de extensos lamelipodios. Al evaluar el rol de la síntesis endógena en la migración del EPR, comprobamos que el tratamiento de los cultivos con NVP231 inhibió la formación de lamelipodios y bloqueó la migración de las células epiteliales. Determinamos, mediante el ensayo de MTT, que el tratamiento con NVP231 no alteró la viabilidad de las células del EPR. La C1P y la S1P promovieron la migración de las células del EPR, pero cuando los cultivos fueron tratados con NVP231 antes del agregado de estos esfingolípidos, el aumento de la migración que promovían fue bloqueado. Estos resultados demuestran que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración promovida por C1P y S1P, evidenciando que la síntesis de C1P es clave en la estimulación de la migración por estos dos esfingolípidos. A continuación evaluamos el rol de C1P en la proliferación. Ensayos de incorporación del nucleótido BrdU en cultivos no confluentes demostraron que el agregado de C1P no alteró la proliferación ni en los cultivos gliales ni en los epiteliales. La inhibición de la síntesis de C1P redujo la proliferación en las CGM, mientras que no alteró la tasa de proliferación de los cultivos epiteliales, lo que sugiere que la C1P sería un mediador necesario para la proliferación glial en el período activo de mitogénesis de estas células. En conclusión, en este trabajo evidenciamos por primera vez que la C1P agregada exógenamente como así también aquella sintetizada por CerK en el interior celular, potenciaron la migración de las CGM y de las células del EPR. Demostramos también que la síntesis de C1P fue necesaria para la proliferación glial. Considerando la importancia del proceso de migración y proliferación en los dos tipos celulares de la retina decisivos en la mayoría de las enfermedades retinianas, proponemos a C1P/CerK como clave en el desarrollo y avance de las retinopatías proliferativas. / Retinal neurodegenerative diseases are the main cause of visual dysfunction in the developed world. Their common feature is the degeneration and eventual death of photoreceptors, which leads to visual impairment and eventual blindness in the most severe cases. Müller Glial Cells (MGC) are the main type of retinal glia and along with the Retinal Pigmented Epithelium (RPE) these cell types are two key factors in both the prevention and progression of these diseases. Under physiological conditions, MGCs and the RPE are in charge of the structural, physiological and functional maintenance of the retina. When faced with physiological changes or different damages, they alter their regular functions in order to either reestablish a proper environment or repair the existing damages; however, if the damage persists, the long-term changes of their aforementioned functions can be counterproductive and contribute to the development of retinal neurodegenerative pathologies. Proliferation and migration are activated as an unspecific response upon different damages in order to repair them but, due to unknown mechanisms, these processes finally provoke retina structural and functional loss, thus contributing to the progression of the visual dysfunction. The elucidation of the regulatory mechanisms involved in controlling migration and proliferation, including the molecules involved, is crucial for developing an integral treatment of these diseases. Bioactive sphingolipids are signaling molecules that regulate a wide array of biological processes, such as survival, proliferation, migration and inflammation. Among them, ceramide-1-phospate (C1P) is a sphingolipid generated by ceramide kinase (CerK), the enzyme responsible of phosphorylating ceramide (Cer) molecules. CerK activity has a central role in C1P-mediated cellular signaling, and is regulated by low levels of Ca2+, phosphorylation and many other stimuli. C1P promotes proliferation by activating several intracellular signaling pathways, as well as promoting inflammation by coupling with and activating the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), which participates in prostaglandin synthesis. Both for proliferation and migration, it has been proposed that C1P activates a (partially identified) specific extracellular receptor. Previous work from our group has shown that sphingosine-1-phospate (S1P), which is metabolically closely related to C1P, promotes MGC migration (Simón et al. 2015). Due to the close interconversions and functions of sphingolipids, uncovering the role of C1P in the processes involved in proliferative retinopathies is highly relevant. The purpose of this thesis is to investigate whether C1P and CerK participate in the regulation of migration and proliferation of MGC and RPE. By using the scratch wound assay in pure rat glial cultures and the RPE cell line ARPE-19, we assessed the effects of C1P/CerK in the migration of these two cell types. In these cellular motility assays we considered the reduction on the wound width as a positive indicator of cell migration. When evaluating the effect of C1P on migration, we determined that C1P enhanced migration by reorganizing the actin cytoskeleton and the formation of filopodia and lamellipodia. By quantifying the uptake of Bromide-deoxyuridine (BrdU) by MGC we determined that proliferation did not contribute to the reduction in the scratch width. We also investigated the signaling pathways involved in this process. Inhibition of PI3K/Akt and JNK pathways with the selective inhibitors LY294002 and SP600125, respectively, showed a decrease in glial migration in both control and C1Ptreated cultures. Western Blot assays showed that the addition of C1P increased the levels of p-Akt (the active form of Akt) when compared to controls, therefore confirming the activation of this pathway. Selective inhibition of the ERK/MAPK pathway with U0126 showed a decrease in C1P-induced migration, but did not alter it in control conditions. We also evaluated the role of cPLA2, a mediator of C1P in inflammation, which is activated by C1P binding. Treatment with ATK, a selective inhibitor of cPLA2, showed a substantial decrease in migration on C1P-treated cultures, while there was no alteration of the migrating capabilities in control conditions. We therefore showed that C1P is a promotor of MGC migration by activating cPLA2 as well as the JNK, PI3K and ERK/MAPK pathways. In addition, the combined addition of C1P and S1P showed that these sphingolipids had the same effect together than when they were added separately, suggesting either a direct relation between them or with the downstream mechanisms they trigger. Since we determined a basal reduction in the scratch width in control conditions, we evaluated whether the endogenous synthesis of C1P was involved in this migration. Initially, we established by RT-PCR assays that CGM expressed CerK. By incubating glial cultures with NVP231, a selective inhibitor of CerK, we showed that endogenous C1P synthesis was necessary for glial migration under control conditions, and that when this synthesis was inhibited addition of C1P did not restore cell migration. In order to verify that NVP231 did not affect cell viability, we evaluated viability by the MTT assay. We determined that treatment of glial cultures with NVP231 did not alter cell viability. On RPE cells, treatment with C1P increased cell migration by inducing actin cytoskeleton reorganization and extensive development of lamellipodia. When evaluating the role of the endogenous synthesis on RPE migration, we concluded that treating cultures with NVP231 inhibited lamellipodia formation and blocked RPE migration. We also determined that the viability of NVP231-treated RPE cells was not altered. Both C1P and S1P promoted RPE cell migration, but treating the cultures with NVP231 beforehand, abolished the migratory stimulus. These results show that endogenous C1P synthesis is essential for C1P and S1P-promoted migration, establishing that C1P synthesis is crucial to promote the migration of these two sphingolipids. Furthermore, we evaluated the possible role of C1P on cell proliferation. BrdU uptake assays on non-confluent cultures showed that the addition of C1P did not alter the proliferating capabilities on either MGC or RPE cultures. The inhibition of C1P synthesis impaired proliferation of MGCs, but did not affect that of RPE cells, suggesting that C1P might be a necessary mediator for glial proliferation in the active mitogenic stage of these cells. In this work we showed for the first time that both addition of C1P as well as the endogenous C1P produced by CerK promote migration of MGC and RPE cells. We also demonstrated that C1P synthesis is required for glial proliferation. Taking into consideration the relevance of migration and proliferation of both cell types in the development of most retinal diseases, we propose that C1P/CerK is instrumental in the development and progression of proliferative retinopathies.

[ES] Las poliaminas son metabolitos esenciales para el crecimiento de las células eucariotas y su metabolismo está frecuentemente desregulado en cáncer. Una de las dianas moleculares de las poliaminas es el factor de elongación de la traducción eIF5A, una proteína esencial y conservada evolutivamente. eIF5A es la única proteína conocida que contiene el aminoácido hipusina, que deriva de la poliamina espermidina. En humanos existen dos isoformas, eIF5A1 y eIF5A2. EIF5A2 se encuentra en el cromosoma 3q26, una región frecuentemente amplificada en muchos tumores y que está altamente expresada en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). eIF5A2 es esencial para el mantenimiento de la proliferación celular y su inhibición la suprime en algunos tumores. Recientemente se ha correlacionado la sobreexpresión de eIF5A2 con la invasión y como biomarcador de mal pronóstico en algunos cánceres, y se ha observado que eIF5A2 induce la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en CPNM. La EMT es un proceso complejo y reversible que induce la diferenciación de las células epiteliales a células mesenquimales migrantes con capacidad de invasión. Numerosos estudios han demostrado que la EMT está relacionada con la progresión del cáncer, metástasis y mal pronóstico en tumores. Por tanto, la determinación de un método eficaz para inhibir la EMT en CPNM podría mejorar significativamente los tratamientos actuales. La naturaleza altamente selectiva de la hipusinación de eIF5A2 y su susceptibilidad a la inhibición farmacológica sugieren que eIF5A2 es una diana terapéutica muy atractiva. Actualmente, se dispone de un análogo de poliamina, GC7, que se utiliza para inhibir la hipusinación y se ha demostrado que frena el crecimiento de células cancerosas. El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo caracterizar el papel patológico de eIF5A2 en el desarrollo del CPNM. Para ello, hemos estudiado, mediante modificaciones genéticas por silenciamiento y sobreexpresión, el papel de eIF5A2 en la proliferación, motilidad e invasión celular utilizando líneas celulares de CPNM. Así mismo, se ha estudiado el efecto del inhibidor GC7 en líneas celulares de CPNM y modelos murinos para determinar si previene o revierte la EMT, y reduce la migración y la invasión de células de CPNM. Por último, se ha analizado la correlación entre la expresión de eIF5A2, las variables clínico-patológicas y la supervivencia de los pacientes en una colección de muestras de pacientes con CPNM. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una regulación entre las isoformas eIF5A1 y eIF5A2 para compensar la expresión de ambos homólogos. Además, nuestros datos apuntan a una coordinación temporal y posicional entre las vías de TGFß1 y eIF5A2 para impulsar la traducción de proteínas requerida para el reordenamiento del citoesqueleto y la motilidad de las células cancerosas invasivas. Hemos demostrado con modelos de ratón in vivo, que los tumores generados mediante xenotrasplante de células que sobreexpresan eIF5A2 tienen mayor capacidad invasiva. Finalmente, mostramos la existencia de una correlación positiva entre la expresión de eIF5A2 y el marcador de proliferación Ki67 en tejido de tumores de CPNM, y que la tasa de supervivencia es menor en aquellos pacientes que expresan niveles elevados de eIF5A2. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman que eIF5A2 podría ser empleado como un biomarcador de mal pronóstico en CPNM y su inhibición farmacológica podría emplearse como una posible herramienta terapéutica, sola o en combinación con otros fármacos, en aquellos casos en los que eIF5A2 se encuentre sobreexpresado. / [CA] Les poliamines són metabòlits essencials per al creixement de les cèl·lules eucariotes i el seu metabolisme està frequentment desregulat en càncer. Una de les dianes moleculars de les poliamines és el factor d'elongació de la traducció eIF5A, una proteïna essencial i conservada evolutivament. eIF5A és l'única proteïna cel·lular coneguda que conté l'aminoàcid hipusina, que deriva de la poliamina espermidina. En humans hi ha dues isoformes, eIF5A1 i eIF5A2. EIF5A2 es troba al cromosoma 3q26, una regió freqüentment amplificada en molts tumors, i que està altament expressada en diferent tipus de càncer, incloent el càncer de pulmó no microcític (CPNM). eIF5A2 és essencial per al manteniment de la proliferació cel·lular i la seva inhibició la suprimeix en alguns tumors. Recentment s'ha correlacionat la sobreexpressió d'eIF5A2 amb la invasió i com a biomarcador de mal pronòstic a alguns càncers i s'ha observat que eIF5A2 indueix la transicició epiteli-mesenquima (EMT) en CPNM. L'EMT és un procés complex i reversible que indueix la diferenciació de les cèl·lules epitelials a cèl·lules mesenquimals migrants amb capacitat d'invasió. Nombrosos estudis han demostrat que l'EMT està relacionada amb la progressió del càncer, la metàstasi i el mal pronòstic en molts tumors. Per tant, la determinació d'un mètode eficaç per inhibir l'EMT a CPNM podria millorar significativament els règims dels tractaments actuals. La naturalesa altament selectiva de la hipusinació d'eIF5A2 i la susceptibilitat a la inhibició farmacològica fan d'aquesta proteina una diana terapèutica molt atractiva. Actualment, es disposa d'un anàleg de poliamina, anomenat GC7, que s'utilitza per inactivar la reacció d'hipusinació i s'ha demostrat que inhibeix el creixement de cèl·lules canceroses. Aquest treball de tesi doctoral té com a objectiu caracteritzar el paper patològic d'eIF5A2 en el desenvolupament del CPNM. Per això, hem estudiat, mitjançant modificacions genètiques per silenciament i sobreexpressió, el paper d'eIF5A2 en la proliferació, la motilitat i la invasió cel·lular utilitzant línies cel·lulars de càncer de pulmó. Així mateix, s'ha estudiat l'efecte de l'inhibidor GC7 en línies cel·lulars de CPNM i models murins per determinar si augmenta la quimiosensibilitat de les cèl·lules, prevé o reverteix l'EMT i redueix la migració i la invasió de cèl·lules de CPNM. Finalment, s'ha analitzat la correlació entre l'expressió d'eIF5A2, les variables clinicopatològiques i la supervivència dels pacients en una col·lecció de mostres de pacients amb CPNM. Els resultats obtinguts suggereixen que hi ha una regulació entre les isoformes eIF5A1 i eIF5A2 per compensar l'expressió dels dos homòlegs. A més, les nostres dades apunten a una coordinació temporal i posicional entre les vies de TGFß1 i eIF5A2 per impulsar la traducció requerida de proteïnes per als reordenaments del citosquelet i les característiques de motilitat de les cèl·lules canceroses invasives. Hem demostrat amb models de ratolí in vivo que els tumors generats mitjançant xenotrasplantament de cèl·lules que sobreexpressen eIF5A2 tenen més capacitat invasiva. Finalment, mostrem l'existència una correlació positiva entre l'expressió d'eIF5A2 i el marcador de proliferació Ki67 en teixit de tumors de CPNM, i que la taxa de supervivència és menor en aquells pacients que expressaven alts nivells d'eIF5A2. Els resultats obtinguts en aquest treball confirmen que eIF5A2 podria ser emprat com un biomarcador de mal pronòstic a CPNM i la seva inhibició farmacològica podria utilitzar-se com una possible eina terapèutica, sola o en combinació amb altres fàrmacs, en aquells casos en què eIF5A2 es trobe sobreexpressat. / [EN] Polyamines are essential metabolites for eukaryotic cells growth, and their metabolism is frequently deregulated in cancer. One of the molecular targets of polyamines is the translation elongation factor eIF5A, an essential and evolutionarily conserved protein. eIF5A is the only protein known that contains the amino acid hypusine, which is derived from the polyamine spermidine. In humans there are two isoforms, eIF5A1 and eIF5A2. EIF5A2 is located on chromosome 3q26, a region frequently amplified in different types of cancer, including non-small cell lung cancer (NSCLC). eIF5A2 is essential for the maintenance of cell proliferation and its inhibition suppresses it in many tumors. Recently, eIF5A2 overexpression has been correlated with invasion and as a biomarker of poor prognosis in some cancers, and it has been observed that eIF5A2 induces epithelial-mesenchymal transition (EMT) in NSCLC. EMT is a complex and reversible process that induces the differentiation of epithelial cells into migrant mesenchymal cells with invasive capacity. Numerous studies have shown that EMT is related to cancer progression, metastasis, and poor prognosis in many tumors. Therefore, the determination of an effective method to inhibit EMT in NSCLC could significantly improve current treatment regimens. The highly selective nature of eIF5A2 hypusination and its susceptibility to pharmacological inhibition make this process a very attractive therapeutic target. Currently, a polyamine analog, called GC7, is available and is used to inactivate the hypusination reaction and has been shown to inhibit cancer cell growth. The objective of this doctoral thesis is to characterize the pathological role of eIF5A2 in the development of NSCLC. For this, we have studied, through genetic alterations by silencing and overexpression, the role of eIF5A2 in cell proliferation, motility and invasion using lung cancer cell lines. Likewise, the effect of the GC7 inhibitor in NSCLC cell lines and murine models has been studied to determine if it increases the chemosensitivity of cells, prevents or reverses EMT, and reduces migration and invasion of NSCLC cells. Finally, the correlation between the expression of eIF5A2, clinicopathological variables and patient survival has been analyzed in a collection of samples from patients with NSCLC. The results obtained suggest the existence of a regulation between the eIF5A1 and eIF5A2 isoforms to compensate the expression of both homologues. Furthermore, our data point to a temporal and positional coordination between the TGFß1 and eIF5A2 pathways to drive the required translation of proteins for cytoskeletal rearrangements and motility characteristics of invasive cancer cells. We have demonstrated with in vivo mouse models that tumors generated by xenotransplantation of cells that overexpress eIF5A2 have a greater invasive capacity. Finally, we show the existence of a positive correlation between the expression of eIF5A2 and the proliferation marker Ki67 in NSCLC tumor tissue, and that the survival rate is lower in those patients who expressed high levels of eIF5A2. The results obtained in this work confirm that eIF5A2 could be used as a biomarker of poor prognosis in NSCLC and its pharmacological inhibition could be used as a possible therapeutic tool, alone or in combination with other drugs, in those cases in which eIF5A2 is found overexpressed. / Martínez Férriz, A. (2023). Funciones del factor de inicio de la traducción eucariota 5A2 en el cáncer de pulmón [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193293