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Mecanismos moleculares de protección en la retinaChucair, Ana Julia 05 March 2012 (has links)
En este trabajo de tesis nos concentramos en dos compo-nentes principales del sistema endógeno de defensa, impli-cados en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas
de la retina: la línea de defensa antioxidante, y las citoquinas de estrés. En el capitulo I, investigamos si los antioxidantes zeaxantina (ZEA), luteína (LUT), y β-caroteno (BC), los principales carotenoides de la dieta, protegen a los fotorre-ceptores del estrés oxidativo y si esa protección es sinérgica con la impartida por el ácido docosahexaenoico (DHA). Reali-zando cultivos neuronales puros de retinas de rata, encon-tramos que los pretratamientos con DHA, ZEA, LUT y BC redujeron la muerte de los fotorreceptores inducida por dos tipos de agentes oxidantes, paraquat (PQ) y peróxido de hi-drógeno (H2O2). Además de este efecto, ZEA y LUT incre-mentaron la diferenciación de los fotorreceptores, aumen-tando la expresión de opsina y promoviendo el desarrollo de
procesos característicos de fotorreceptores maduros. Nues-tros resultados sugieren que las xantófilas ZEA y LUT junto al DHA podrían ser importantes factores ambientales que contri-buyen a la promoción de la supervivencia y diferenciación de los fotorreceptores. En el capitulo II, utilizamos los cultivos neuronales puros de retina de rata para estudiar el efecto protector directo de la neurocitoquina de estrés, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), sobre fotorreceptores sujetos al estrés oxidativo inducido por PQ. Observamos que el pretrata-miento con LIF redujo la muerte celular y disminuyó la
expresión de opsina en los cultivos, en una forma dependiente de la concentración. LIF activó la vía de señalización gp130/STAT3, lo que sugiere que este modelo es una poten-te herramienta para facilitar el estudio de los mecanismos que dirigen los efectos en la protección y en la diferenciación de LIF en los fotorreceptores de la retina. En el capítulo III investigamos mecanismos endógenos de neuroprotección de
fotorreceptores in vivo en ratones usando un modelo de precondicionamiento con ciclos de luz/oscuridad (PC), seguido por exposición a daño agudo por luz (LD). Trabajos previos en el laboratorio del Dr. Ash demostraron que El PC induce la expresión de LIF y la activación de la vía gp130/STAT3. Aquí demostramos que el PC con luz moderada, previo al LD resultó en casi completa protección funcional y morfológica de los
fotorreceptores. Estudiamos si el mecanismo de esta protección involucra la disminución en la acumulación de productos de oxidación. Hallamos que LD induce la oxidación de ADN en fotorreceptores. El PC previo redujo la oxidación de ADN como parte de la respuesta endógena de neuropro-tección inducida por este modelo. En el capítulo IV, investiga-mos si la activación de STAT3 inducida por LIF altera la
actividad biológica de las células del epitelio pigmentado de la retina (RPE) in vivo. Generamos modelos de ratones knock-out para específicamente delecionar STAT3 o gp130 en el RPE, en la retina, o en ambos retina y RPE y realizamos inyecciones
intravítreas de LIF en estos modelos. Establecimos que LIF regula negativamente la expresión y actividad de la isomerohidrolasa RPE65, componente clave del ciclo visual
en el RPE, de manera coordinada con una reducción en la expresión de la rodopsina en
los fotorreceptores, para disminuir la síntesis del fotopigmento visual. Dicha regulación
se postula como neuroprotectora de la exposición al estrés por luz, o de enfermedades
neurodegenerativas de la retina. Estos efectos en la retina y en el RPE fueron
independientes y requirieron la activación de la vía de señalización gp130/STAT3
intrínseca de la retina y del RPE, respectivamente. / In this thesis, we focused on two main components of the endogenous defense system implicated in neurodegenerative diseases in the retina: the antioxidant line of defense and
stress cytokines.In chapter I, we investigated whether the main carotenoids from the diet:zeaxantin (ZEA), lutein (LUT), and β-carotene (BC), protect photoreceptors from
oxidative stress and whether this protection is synergis-tic with that given by docosahexaenoic acid (DHA). By per-forming pure neuronal cultures from rat retinas, we found that pretreatment with DHA, ZEA, LUT and BC reduced photo-receptor apoptotic cell death induced by two types of oxidants, paraquat (PQ) and hydrogen peroxide (H2O2).Also, ZEA and LUT increased the expression of opsin and promoted the development of processes that are characteristic of mature photoreceptors. Our results suggest that the xantho-phylls ZEA and LUT along with DHA could be important envi-ronmental cues contributing to the promotion of photore-ceptor survival and differentiation. In chapter II, we used pure neuronal cultures from rat retinas to study the direct effects of the stress neurocytokine, leukemia inhi-bitory factor (LIF), on photoreceptors exposed to oxidati-ve stress induced by PQ. We observed that pretreatment with LIF reduced photoreceptor cell death and decreased opsin expression in primary retinal neurons, in a dose-de-pendent manner. LIF activated the gp130/STAT3 signaling pathway, which suggests this model as a potent tool that could ease the study on mechanisms involved in
the effects induced by LIF on photoreceptor survival and differentiation.
In chapter III, we examined endogenous protective mechanisms of photoreceptor in
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vivo, in mice exposed to a model of preconditioning with cycles of light/darkness (PC)
followed by exposure to acute light damage (LD). Previous work in Dr. Ashs laboratory
has demonstrated that the primary endogenous neuroprotective response in this model is
the upregulation of LIF and increased gp130/STAT3 signaling in photoreceptors. Here,
we demonstrated that PC with moderate levels of light prior to LD resulted in almost
complete functional and morphological protection of photoreceptors. We studied whether
the mechanism mediating this protection involved a reduction in the accumulations of
oxidation products. We found that LD induced DNA oxidation in photoreceptors, but the
prior treatment with PC decreased such oxidation as a part of the endogenous response
induced by this model.
In chapter IV, we aimed to investigate whether the activation of STAT3 induced by
LIF alters the biological activities of the retinal pigmented epithelium (RPE) in vivo. We
generated conditional knock-out mouse models with specific deletion of STAT3 or gp130
in the RPE, in the retina, or in both retina and RPE and we performed intravitreal
injections of LIF in these animals. Our studies allowed us to establish that LIF
downregulates the expression and activity of the isomerohydrolase RPE65, a key
component in the visual cycle in the RPE, which is coordinated with a decrease in the
expression of rhodopsin in photoreceptors, to diminish the synthesis of the visual
photopigment. This coordinated downregulation is postulated to be neuroprotective in
both light stress and in neurodegenerative diseases in the retina. The effects induced by
LIF in the retina and the RPE were independent from each other and required the
activation of the gp130/STAT3 signaling pathway intrinsic to retina and RPE,
respectively.
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La vía de la fosfolipasa D en las células del epitelio pigmentario de la retina : su rol en la patogénesis de la retinopatía diabética y otras enfermedades inflamatorias de la retinaTenconi, Paula Estefanía 07 April 2020 (has links)
La inflamación es un factor clave en la patogénesis de diversas enfermedades de la retina que eventualmente terminan en la pérdida de la visión y ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinopatía diabética (RD), endolftalmitis bacteriana y la uveítis. En este contexto, las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son esenciales para mantener la integridad estructural y funcional de la retina y se ha demostrado que, en estas condiciones patológicas, el EPR puede mediar importantes funciones inmunológicas y participar activamente de la respuesta inflamatoria.
El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR. En particular nos propusimos estudiar el rol de la vía de la fosfolipasa D (PLD), generadora de mensajeros lipídicos, en dos modelos de injuria inflamatoria: i) inducida por lipopolisacárido (LPS) y ii) por altas concentraciones de glucosa (HG), a modo de simular las hiperglucemias características de la diabetes. En el desarrollo de esta tesis utilizamos dos líneas celulares de EPR de origen humano, las líneas ARPE-19 y D407.
Las PLD clásicas hidrolizan fosfatidilcolina (PC) para generar un segundo mensajero lipídico, el ácido fosfatídico (PA) y colina. El PA puede desfosforilarse por las lípido fosfato fosfohidrolasas (LPP) para generar diacilglicerol (DAG), otro lípido bioactivo. Por lo tanto, la vía de PLD/LPP puede modular la actividad de las proteínas que responden al DAG, como las proteínas quinasas C (PKC) y también de proteínas que son moduladas por el PA, como mTOR (del inglés, mammalian target of rapamycin), entre otras.
Resultados previos de nuestro laboratorio habían demostrado la activación de la vía PLD y la participación de las isoformas clásicas (PLD1 y PLD2) en la respuesta inflamatoria de las células del EPR expuestas a LPS. En el capítulo I estudiamos el rol de la vía PLD en la activación de la señalización por PKC en las células del EPR expuestas a LPS. Demostramos que ambas PLD clásicas son necesarias para la activación de isoformas convencionales de PKC (α y βII), mientras que la activación de la isoforma novel PKCε solo es dependiente de la PLD1. Evidenciamos además que la PKCε media la supervivencia de las células del EPR expuestas al LPS promoviendo una menor activación de la caspasa-3 y aumentando la expresión de Bcl-2 y la activación de Akt. Por otra parte, las PKCα y β no estarían involucradas en la pérdida de la viabilidad inducida por el LPS. En conclusión, la vía PLD1-PKCε media la supervivencia de las células del EPR previniendo las señales apoptóticas inducidas por el LPS.
En el capítulo II caracterizamos el modelo de injuria celular inducido por HG. La exposición de las células del EPR a HG indujo la generación de especies reactivas de oxígeno
(ROS), la activación de la caspasa-3 y la disminución de la funcionalidad mitocondrial (parámetro de viabilidad celular). Demostramos además que los niveles elevados de glucosa inducen en las células del EPR la activación temprana y concatenada de la vía PLD y de la quinasa regulada por factores extracelulares (ERK1/2), la fosforilación del inhibidor de κB (IκB) y la activación del factor de transcripción nuclear κB (NFκB). La activación del NFκB inducida por la HG se correlacionó con el incremento en la expresión de los ARNm de interleuquinas (IL) proinflamatorias (IL-6, IL-8) y de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Finalmente, demostramos que en las células del EPR expuestas a HG los inhibidores farmacológicos de PLD1 (VU0359595) y de PLD2 (VU0285655-1) previenen la expresión de los mediadores proinflamatorios, la activación de la caspasa-3 y la reducción en la viabilidad celular.
Los resultados obtenidos en las células expuestas a LPS y al modelo de injuria inducida por HG demuestran que el rol de las PLD en las células del EPR difiere según cuál sea el origen de la injuria inflamatoria. Estos hallazgos indican la importancia de conocer los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR desencadenada por distintos estímulos. Nuestros resultados postulan a las isoformas clásicas de PLD como posibles dianas terapéuticas para distintas enfermedades inflamatorias de la retina. / Inflammation is a key factor in the pathogenesis of several retinal diseases that eventually end in vision loss and blindness, such as age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (DR), retinitis pigmentosa (RP) and uveitis. In this context, retinal pigment epithelial (RPE) cells are essential to maintain the integrity and function of the retina and it has been shown that, under these pathological conditions, RPE cells can mediate important immunological functions and actively participate in the inflammatory response.
The main objective of this Ph. thesis was to elucidate the molecular mechanisms involved in the inflammatory response of the RPE. In particular, we wanted to study the role of the lipid messenger generating phospholipase D (PLD) pathway in two inflammatory injury models: i) induced by lipopolysaccharide (LPS) and ii) by high glucose (HG) concentrations, in order to simulate the typical hyperglycemia of diabetes. To this end, we used two human RPE cell lines: ARPE-19 and D407. Classical PLDs hydrolyze phosphatidylcholine (PC) to generate the lipid second messenger, phosphatidic acid (PA), and choline. PA can be further dephosphorylated by lipid phosphate phosphatases (LPP) in order to generate diacylglycerol (DAG), another lipid messenger. Thus, the PLD/LPP pathway can modulate the activity of DAG-responding proteins, such as protein kinases C (PKCs) and PA-responding proteins such as mTOR (mammalian target of rapamycin), among others.
Previous results from our laboratory demonstrated the activation of the PLD pathway and the participation of classical PLD isoforms (PLD1 and PLD2) in the inflammatory response of RPE cells exposed to LPS. In the first chapter of this thesis, we studied the role of the PLD pathway in the activation of LPS-induced PKC signaling in RPE cells. We demonstrated that both PLDs are necessary for the activation of conventional PKC isoforms (PKCα/βII) while the activation of the novel PKCε is dependent only on PLD1. We also showed that PKCε mediates the survival of RPE cells exposed to LPS by promoting less activation of caspase-3 and increasing Bcl-2 expression and activation of Akt. In contrast, PKCα and β may not be involved in the cell viability loss induced by LPS. In conclusion, the PLD1-PKCε pathway mediates RPE cell survival by preventing apoptotic signals induced by LPS.
In chapter II we characterized the model of cellular injury induced by HG. RPE cell exposure to HG induced reactive oxygen species (ROS) generation, caspase-3 activation and reduced mitochondrial functionality (cell viability parameter). We also demonstrated that in RPE cells high glucose levels induce the early and concatenated activation of the PLD pathway and of extracellular signal regulated kinase (ERK1/2), the phosphorylation of inhibitor of κB (IκB) and the activation of nuclear factor κB (NFκB). The activation NFκB induced by HG was found to correlate with the increased expression of proinflammatory interleukins (IL-6, IL-8)
and cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA. Finally, we demonstrated that in RPE cells exposed to HG pharmacologycal inhibitors of PLD1 (VU0359595) and PLD2 (VU0285655-1) prevent the expression of proinflammation mediators, the activation of caspase-3 and the reduction in cell viability.
The results obtained in RPE cells exposed to LPS and in the model of cellular injury induced by HG demonstrate that the role of PLD isoforms in RPE cells differs depending on the origin of the inflammatory injury. These findings indicate the importance of knowing the molecular mechanisms involved in the RPE inflammatory response elicited by different stimuli. Our results postulate classical PLD isoforms as possible therapeutic targets for several retinal inflammatory diseases. / TEXTO PARCIAL en período de teletrabajo
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