Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias, mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias. / El citoesqueleto es un componente esencial en todas las células. En particular, el
citoesqueleto de Actina cumple múltiples funciones, desde el desarrollo de un
organismo, la migración celular, hasta la formación de distintas estructuras celulares,
tales como pelos cuticulares o tricomas, que corresponden a una extensión de la
membrana plasmática. En Drosophila melanogaster, las células epiteliales forman un
único pelo o tricoma en la zona apico-distal de estas. Durante el desarrollo, esta
estructura se forma por la acumulación polarizada de Actina y su subsecuente
polimerización lineal, la que es finamente regulada. Sin embargo, aún no se tiene claro
cuáles son los mecanismos moleculares que promueven la acumulación y polimerización
de Actina para la formación de pelos en las células epiteliales de insectos como
Drosophila melanogaster.
En nuestro laboratorio se encontró una mutación en un gen no caracterizado en
Drosophila melanogaster. Dicha mutación en homocigosis genera la letalidad del animal
en el periodo embrionario. Para analizar el fenotipo celular asociado a la mutación de
dicho gen, utilizamos mosaicos celulares. Se observó que en células epiteliales mutantes
para pelado, la formación de pelos es inhibida. Junto con esto, en células del sistema
inmune de Drosophila, la pérdida de función de Pelado genera una alteración en la forma celular, las que aparentemente no se adhieren bien a la superficie de contacto. Sin
embargo, al inducir la ganancia de función en estas mismas células se observa la
formación de filopodios. Estos datos en conjunto sugieren que Pelado promueve la
polimerización lineal de Actina durante la formación del pelo.
El fenotipo en la formación de pelos o tricomas generado por la pérdida de función de
Pelado es revertido con la ganancia de función de Diaphanous, que corresponde a una
formina, que nuclea y polimeriza la Actina de manera lineal. Este fenotipo también es
revertido por la pérdida de función de Scar/WAVE, proteína que induce la polimerización
ramificada de Actina. En el caso de los hemocitos, la pérdida de función de Diaphanous
revierte la formación de filopodios inducida por Pelado. Esto indica que la función de
Pelado podría estar mediada por la regulación de la formina Diaphanous.
Se generó una mutante que carece del extremo C-terminal de Pelado con la intención de
determinar si era suficiente para cumplir la función de la proteína completa. Al analizar
el fenotipo de ganancia de función de esta mutante sobre los hemocitos, se observó que
de todas maneras se induce la formación de filopodios. Sin embargo, esta mutante no es
capaz de revertir el fenotipo de pérdida de función de Pelado en la formación del pelo.
Indicando que el extremo N-terminal de Pelado cumple la función de inducir la
polimerización lineal de Actina, pero no así en la formación del pelo.
Finalmente, el análisis de la distribución celular de ambas versiones de Pelado, muestra
que la versión silvestre se localiza más periféricamente que la que carece del extremo Cterminal,
sugiriendo que esta región es necesaria para su localización subcelular durante
el proceso de formación del pelo. / Cytoskeleton is an essential component in every cell. In particular, Actin cytoskeleton
fulfill several functions, from development of an organism, cell migration, to different
cell structures formation, such cellular as hairs or trichomes.
In Drosophila melanogaster, a single hair grows at the distal side of the apical cortex of
every epithelial cell. During development, this structure is formed by the polarized
accumulation of Actin and its subsequent linear polymerization, which is tightly
regulated. However, it is still not clear what are the molecular mechanisms that promote
the accumulation and polymerization of Actin for the hair formation in insects as
Drosophila melanogaster.
In our lab, we found a mutation in an undescribed gene of Drosophila, which in
homozygosity causes embryonic lethality. To analyze the cellular phenotype associated
with this mutation, we use cell mosaics. We observed that in mutant epithelial cells, hair
formation is inhibited. Moreover, loss of function of Pelado in immune cells generates
cell shape defect and its gain of function promotes filopodia formation. All this data
together, indicates that Pelado promotes linear actin polymerization during hair
formation.
The hair formation phenotype generated by Pelado loss of function, is reversed by
Diaphanous gain of function, which is a type of formin, that nucleates and polymerize
Actin in a linearly. This phenotype is also reversed by the Scar/WAVE loss of function, a
protein that induces the branched actin polymerization. In hemocyte cells case, the
Diaphanous loss of function reversed the filopodia formation induced by Pelado gain of
function. This indicates that Pelado function in Actin polymerization could be mediated
by Diaphanous.
In order to start unveiling the role of the different domains of Pelado, we generated a
new mutant, that lacks the C-terminal portion of Pelado. This mutant was generated to
determine whether this region is enough to fulfill the entire protein function. This new
mutant also induces the filopodia formation in hemocytes. However, this mutant is not
able to revert the hair formation phenotype induced by Pelado loss of function,
indicating that the amino portion of Pelado is sufficient to induce linear Actin
polymerization, but not to induce hair formation.
Finally, analyses of cellular distribution of Pelado forms shows that wild type version has
a more peripheral location than the mutant, suggesting that the C-terminal region is
required for its localization. / Mayo 2020
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/168535 |
| Date | 04 1900 |
| Creators | Molina Pelayo, Claudia Macarena |
| Contributors | Glavic Maurer, Álvaro, Olguín, Patricio, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Postgrado |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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