Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Biotecnología Molecular / Los carotenoides son pigmentos que en plantas participan en la fotosíntesis, protección
del daño foto-oxidativo y síntesis de fitohormonas. En mamíferos, su consumo es
esencial, ya que son precursores de la vitamina A. La síntesis de carotenoides en
plantas ha sido bien caracterizada a nivel molecular, centrándose principalmente en los
genes que codifican para las enzimas que son parte de la ruta de síntesis de estos
pigmentos (llamados ‘genes carotenogénicos’). Por otro lado, se ha reportado que la
síntesis de carotenoides en plantas está regulada por diversos factores entre los que
se destaca la luz, la cual induce la expresión de genes y la síntesis y acumulación de
estos pigmentos en hojas, frutos y flores en plantas modelos, como por ejemplo,
tomate, tabaco y Arabidopsis. En el caso de Daucus carota (zanahoria), ésta sintetiza y
acumula una gran cantidad de carotenoides en su raíz de reserva que crece en
oscuridad, contrario a lo reportado en otros modelos, otorgándole su característico
color anaranjado. En este contexto, nuestro grupo de investigación ha determinado que
la luz inhibe reversiblemente la síntesis y acumulación de carotenoides en la raíz de
reserva de zanahoria al privilegiar el desarrollo de cloroplastos (acumuladores de
clorofila) en vez de cromoplastos (acumuladores de carotenoides). Además, a nivel
molecular, se genera una regulación negativa sobre los genes carotenogénicos. Para
comprender el mecanismo regulatorio en Daucus carota, realizamos un RNA-seq para
identificar genes no carotenogénicos reprimidos por la luz en la raíz de Daucus carota,
al comparar raíces de 8 semanas crecidas en luz (R/L) versus raíces crecidas en
oscuridad (R/O). Entre los genes identificados se encuentran aquellos involucrados en
procesos de señalización mediados por hormonas y genes que participan en la biogénesis de plastidios y cromoplastos. Sin embargo, un grupo importante de genes
que nos llamo la atención fueron aquellos que participan en cascadas de señalización
mediadas por luz, entre los que están PhyA, PhyB, Par1, Pif4, entre otros. De ellos, se
seleccionó el gen Par1 que corresponde a un cofactor transcripcional involucrado en el
síndrome de huida de la sombra (SAS) y la fotomorfogénesis. La caracterización
funcional de DcPar1 mediante su silenciamiento post-transcripcional en zanahoria,
provocó una disminución de entre 4 a 60 veces en los niveles de α y β-caroteno en la
raíz, mientras que la expresión constitutiva del gen ortólogo AtPar1 de Arabidopsis
provocó un aumento de 2,4 veces más de β-caroteno en la raíz de zanahoria. Lo
anterior se correlacionó con los niveles de transcritos de genes carotenogénicos claves
como DcPsy1 y DcPsy2, los que disminuyeron sus niveles de expresión relativa en las
plantas silenciadas para DcPar1, mientras que DcPsy1 aumentó sus niveles de
transcritos en zanahorias que expresaron el gen AtPar1. Estos resultados nos permiten
sugerir que el gen Par1 posee un rol regulatorio sobre la síntesis y/o acumulación de
carotenoides de la raíz de zanahoria que crece en oscuridad.
Este trabajo además, nos permitió ampliar nuestro conocimiento respecto de los
mecanismos regulatorios de la síntesis y/o acumulación de carotenoides en zanahoria,
además de proponer al gen DcPar1 como un gen blanco a manipular con el propósito
de aumentar los niveles de estos compuestos antioxidantes en cultivos de interés
económico. / The carotenoids are isoprenoids pigments synthesized by plants, algae and by some
yeast and bacteria. In plants, these pigments play fundamental functions related with
photosynthesis, photo-oxidative protection and synthesis of phytohormones.
The synthesis of carotenoids in plants has been well characterized at the molecular
level in plants, however these studies have focused mainly on the carotenogenic genes
that are part of carotenoid biosynthesis pathway, while the study of non-carotenogenic
genes is scarce. On the other hand, it has been reported that the synthesis of
carotenoids in plants is regulated by light, which would induce the synthesis and
accumulation of these pigments in leaves, fruits and flowers in model plants such as
tomato, tobacco and Arabidopsis. Daucus carota (carrot) synthesizes and accumulates
a large amount of carotenoids in its root that grows in darkness, contrary to that
reported in other plant models, allowing this organ to acquire its characteristic orange
color.
Our research group has determined that light inhibits the carotenoid synthesis and
accumulation in the carrot root, causing the development of chloroplasts (chlorophyll
accumulators) instead of chromoplasts (carotenoid accumulators) in the root.
Furthermore, at the molecular level, a negative regulation is generated on the
carotenogenic genes. This background allows us to propose that light plays an
inhibitory role in the carotenoid synthesis in the carrot root that causes this plant to
behave distinctly to other plant models. The carotenogenic genes of various plants and
those of carrots, have been widely characterized. Considering that light has a negative
effect on carotenoid synthesis in carrot root, in this work we identified noncarotenogenic genes repressed by light in the root of Daucus carota, performing an
RNA-Seq analysis from 8-week old roots grown in light (R/L) versus roots grown in
darkness (R/O). Among the differentially expressed genes (DEGs) identified are those
involved in hormone signaling and genes involved in plastid and chromoplast
biogenesis. However, an important group of genes that caught our attention were those
that participate in light-mediated signaling, among which are PhyA, PhyB, Par1, Pif4,
among others. Of these, the Par1 gene was selected. Par1 encodes a transcriptional
cofactor involved in the shade avoidance syndrome (SAS) and photomorphogenesis.
The functional characterization of DcPar1 by post-transcriptional silencing in carrot,
caused a decrease in the levels of α and β-carotene in the root from 4 to 60 times, while
the constitutive expression of the Arabidopsis orthologous gene AtPar1 caused an
increase in β-carotene in the carrot root from 2.4 times. This was correlated with the
transcripts levels of key carotenogenic genes such as DcPsy1 and DcPsy2, which
decreased their relative expression levels in DcPar1 silenced plants, while DcPsy1
increased their transcripts levels in carrots that expressed AtPar1 gene. These results
allow us to suggest that the Par1 gene has a regulatory role on the synthesis and/or
accumulation of carotenoids in the carrot root that grows in darkness.
This work allowed us to expand our knowledge regarding the regulatory mechanisms of
the synthesis and/or accumulation of carotenoids in carrots, in addition to proposing the
DcPar1 gene as a target gene to manipulate with the purpose of increasing the
antioxidant compounds levels in economic interest crops.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/170021 |
| Date | 06 1900 |
| Creators | Arias González, Daniela Loreto |
| Contributors | Stange Klein, Claudia, Silva Asencio, Herman, Cifuentes Guzmán, Víctor, Guiliani Guerin, Nicolás, Norambuena Morales, Lorena, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Postgrado |
| Publisher | Universidad de Chile. |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | English |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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