Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Eleni Gomes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Fernanda Canduri / Banca: Wagner Alves de Souza Júdice / Resumo: Aspártico (E.C. 3.4.23), cisteíno (E.C. 3.4.22) e serino peptidases (E.C. 3.4.21) são endopeptidases, cujos modos de ação são dependentes de resíduos de ácido aspártico, cisteína e serina presentes no sítio catalítico, respectivamente. Atualmente, vários estudos são realizados na busca por novas enzimas com relevantes propriedades bioquímicas para aplicação industrial. Neste contexto, nós propomos a produção de enzimas em bioprocesso submerso, purificação, estudo das propriedades bioquímicas e determinação da especificidade catalítica das peptidases secretadas pelos fungos filamentosos Rhizomucor miehei, Phanerochaete chrysosporium e Leptosphaeria sp. Inicialmente, após produção por bioprocesso submerso, estas enzimas foram purificadas utilizando cromatografias de exclusão molecular e troca iônica. Em ensaios de inibidores na atividade enzimática, notamos inibição das peptidases por pepstatina A (R. miehei), ácido iodoacético/N-Etilmaleimida (P. chrysosporium) e fluoreto de fenil metil sulfonila (Leptosphaeria sp), sendo então definidas como aspártico, cisteíno e serino peptidases, respectivamente. Por SDS-PAGE (12%), as massas moleculares foram estimadas em 37 kDa (aspártico), 23 kDa (cisteíno) e 35 kDa (serino). O máximo de atividade proteolítica foi alcançado em pH 5,5 e 55 ºC para peptidase aspártica secretada por R. miehei; pH 7 e faixa de temperatura 45-55 ºC para cisteíno peptidase secretada por P. chrysosporium, e pH 7 e 45 ºC para serino peptidase secretada por Leptosphaeria sp. Sob efeito de incubação a diferentes pH, a peptidase aspártica mostrou-se estável em condições ácidas (pH 3-5); cisteíno peptidase foi estável em ampla faixa de pH (pH 4-9), e serino peptidase mostrou-se mais estável em condições com tendências alcalinas e pH ligeiramente ácido (pH 5-9). Em todas estas faixas de pH citadas, as peptidases apresentaram atividade proteolítica acima de 80% por 1 hora... / Abstract: Aspartic (EC 3.4.23), cysteine (EC 3.4.22) and serine peptidases (EC 3.4.21) are endopeptidases whose modes of action are dependent on aspartic acid, cysteine and serine residues present in the catalytic site, respectively. Currently, several studies are conducted in the search for new enzymes with relevant biochemical properties for industrial application. In this context, we propose the production of enzymes in submerged bioprocess, purification, the study of biochemical properties and determining the catalytic specificity peptidases secreted by the filamentous fungus Rhizomucor miehei, Phanerochaete chrysosporium and Leptosphaeria sp. Initially, after production submerged bioprocess, these enzymes have been purified using size-exclusion and ion exchange chromatographies. In the effect of inhibitors on enzyme activity, we note peptidase inhibition by pepstatin A (R. miehei), iodoacetic acid/ N-Ethylmaleimide (P. chrysosporium) and phenyl methyl sulfonyl fluoride (Leptosphaeria sp), suggesting that these enzymes are aspartic, cysteine and serine peptidases, respectively. For SDS-PAGE (12%), molecular weights were estimated at 37 kDa (aspartic), 23 kDa (cysteine) and 35 kDa (serine). Maximum proteolytic activity was achieved at pH 5.5 and 55 °C for aspartic peptidase secreted by R. miehei; pH 7 and temperature range 45-55 °C for cysteine peptidase secreted by P. chrysosporium and pH 7 and 45 °C for serine peptidase secreted by Leptosphaeria sp. Under incubation at different pH effect, aspartic peptidase was stable under acidic conditions (pH 3-5); cysteine peptidase was stable in wide pH range (pH 4-9), and serine peptidase was more stable under alkaline conditions and pH slightly acidic (pH 5-9). In all these pH ranges mentioned, peptidases showed proteolytic activity above 80% by 1 hour incubation. As regards the thermal stability, cysteine peptidase was more thermostable enzyme and serine peptidase described the lowest temperature ... / Doutor
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UNESP/oai:www.athena.biblioteca.unesp.br:UEP01-000868414 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Silva, Ronivaldo Rodrigues da. |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. |
| Publisher | São José do Rio Preto, |
| Source Sets | Universidade Estadual Paulista |
| Language | Portuguese, Portuguese, Texto em português; resumos em português e inglês |
| Detected Language | English |
| Type | text |
| Format | 114 f. : |
| Relation | Sistema requerido: Adobe Acrobat Reader |
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