Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d’éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l’analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n’est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d’éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L’étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l’expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l’enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d’expliquer la faible efficacité de l’enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l’enzyme. Une technique de mesure d’activité in vitro a été également développée. Une stratégie d’expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d’une protéine d’environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l’extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d’affinité sur colonne d’agarose nickel. Les tests d’activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l’enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l’enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l’acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l’action partielle de la Cfa synthase de O. oeni. / The results obtained in this work have shown that in both lactic acid bacteria models, L. lactis subsp. cremoris and O. oeni, transcription of the cfa gene, encoding the Cfa synthase is stimulated when cells enter stationary phase of growth or when the cells are grown under stress conditions (acidic or presence of ethanol in the medium). The role of the CFAs has been apprehended by the comparative physiological analysis of the parental strain L. lactis subsp. cremoris and a Δcfa mutant generated in this strain. The high percentages of survival obtained in strains grown at pH 5.0 and undergoing acid stress (pH 3.0) prove that the cyclopropanation of unsaturated fatty acids is not essential to the survival of L. lactis subsp. cremoris under conditions of acid stress. In addition, fluorescence anisotropy data show that the presence of membrane CFA does not regulate the level of membrane fluidity, especially with strains grown in the presence of ethanol. The assumption of a balance between palmitoleic acid / cis-vaccenic acid / lactobacillic acid in membrane fluidity regulation in L. lactis subsp. cremoris is advanced. The study of the physiological role of CFA in O. oeni requires cfa gene expression of the bacterium in a heterologous system. The results confirm the functionality of the gene in the host bacterium L. lactis subsp. cremoris. However, the cyclopropanation of the precursor cis-vaccenic acid remains partial in the mutant strain complemented. Biochemical characterization in vitro of the enzyme CFA synthase from O. oeni was therefore undertaken in order to explain the low efficiency of the enzyme of O. oeni in the host bacterium. The work led to the overproduction and purification of the enzyme. A technique for measuring the activity in vitro has also been developed. A strategy of O. oeni cfa gene expression in the heterologous host bacterium E. coli BL21 Star has permitted the surpoduction of a protein of approximately 45 kDa. This data is in agreement with the theoretical molecular weight of the CFA synthase from O. oeni. Protein purification was performed by affinity chromatography on nickel-agarose column. Enzymatic activity assays in vitro have been made. The optimum temperature for the enzyme is 35.8 ° C. Its optimum pH is 5.6. However, we find that the in vitro cyclopropanation of cis-vaccenic acid from membrane phospholipids of the mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa remains partial. This leads to an experimental determination of KM and Vmax values much higher than the data cited in the literature. The difference between the nature and the distribution of membrane phospholipids in the two model bacteria may explain the partial activity of Cfa synthase from O. oeni.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2010DIJOS048 |
| Date | 17 December 2010 |
| Creators | To, Thi Mai Huong |
| Contributors | Dijon, Tourdot-Maréchal, Raphaëlle, Grandvalet, Cosette |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French, English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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