Avec pour problématique une importante variabilité des lots de production vaccinale contre la diphtérie, une analyse intégrative du métabolisme central, du fer et du transcriptome de Corynebacterium diphtheriae, cultivé en conditions les plus proches de la culture industrielle, ont permis d’élargir les connaissances sur le comportement de la bactérie en conditions de production industrielle, et plus particulièrement sur l’existence de corrélations entre activité métabolique et virulence. L'analyse du métabolisme central et la comparaison de l'expression des gènes de C. diphtheriae, ont permis de mettre en évidence l'importance du maltose dans l'établissement de la virulence. Ce sucre, largement présent dans notre alimentation, est ainsi rencontré par la bactérie lors de son processus de colonisation de l'hôte. La consommation du maltose lors de la phase stationnaire, coïncident avec la production de la toxine, semble ainsi liée aux réactions de maintenance et à la production de métabolites secondaires plutôt qu'à la croissance. Plusieurs gènes liés à la capture et au catabolisme du maltose sont liés à la production de la toxine diphtérique. Cependant, les mécanismes de régulation sont complexes, impliquant plusieurs régulateurs. Une étude sur les besoins en fer de la bactérie et les liens avec la pathogénicité a été réalisée. En effet, le gène de la toxine diphtérique est régulé par DtxR, répresseur activé par Fe2+. Elle a permis d'évaluer la capacité de stockage en fer de la bactérie et la limite de concentration intracellulaire pour obtenir une production de toxine. Un effort a été apporté afin de visualiser les ferritines synthétisées par la bactérie par la technique NanoSIMS. Enfin, l'analyse de l'expression des gènes de C.diphtheriae cultivé en condition de limitation en fer et supplémentée en fer a apporté une quantité d'informations sur les liens entre métabolisme central et du fer, virulence et stress oxydatif. Cette démarche a été mise à profit afin de proposer à l'industriel des pistes d'optimisations du procédé et d’améliorations de la productivité en toxine diphtérique. Via l’ajustement de certains paramètres physico-chimiques (visant l'oxygénation et une meilleure métabolisation du maltose), il est possible d'obtenir un gain de production significatif (titre final en toxine multiplié par 2,5). La productivité spécifique en toxine peut être également multipliée par 2,2 par une astucieuse étape de dilution et recyclage de la biomasse en fin de culture / Faced with an important variability in production yields of vaccines against diphtheria, a dynamic systemic approach, including central and iron metabolism and transcriptome analysis, led to an improved knowledge of Corynebacterium diphtheriae physiology, notably as regards the connection of central metabolism and virulence. Gene expression analysis coupled to metabolic characterization enabled a correlation between maltose consumption and virulence to be established. Because of the typical human diet, maltose is present in the human oropharynx where it may serve as a key nutrient source for C. diphtheriae. Maltose consumption during stationary phase, coupled with toxin production, seems to be linked to maintenance and secondary metabolites rather than growth. Several genes, including uptake and catabolism of maltose, are related to diphtheria toxin production. However, mechanisms of regulation are complex and may involve several transcriptional regulators. Bacterial iron requirements and its relation to pathogenicity were considered. Indeed, diphtheria toxin gene is regulated by Fe2+ activated DtxR. These studies revealed that C. diphtheriae is able to store an important quantity of intracellular iron within ferritin-like proteins visualized by NanoSIMS microscopy and the definition of an intracellular threshold concentration provoking expression of toxin production. Finally, genome-wide gene expression analysis of C.diphtheriae in iron starvation and iron excess conditions provided information on relations between central and iron metabolism, virulence establishment and oxidative stress. The resulting knowledge was exploited to suggest process optimization strategies to enhance toxin production, currently being assessed by the industrial partner. Adjusting some key physico-chemical parameters (targeting oxygenation and better maltose metabolization) enabled significant gains in toxin production (2.5 fold increase). Specific productivity could be increased by 2.2 thanks to a novel biomass dilution and recycling step at the end of the culture
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012ISAT0041 |
| Date | 06 December 2012 |
| Creators | Gauriat, Marie-Anne |
| Contributors | Toulouse, INSA, Lindley, Nicholas David, Planard, Marie-France |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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