Les travaux présentés ici portent sur les P1B-ATPases HMA2, HMA3 et HMA4 d'Arabidopsis thaliana, transporteurs de cations présents sur différentes membranes chez les plantes. L'étude du contenu cationique de plantes mutantes hma2 et hma4 a précisé le rôle important de HMA4 dans la translocation du Zn et du Cd vers les parties aériennes et sa forte affinité pour le Cd. La mesure du contenu cationique de graines de différents génotypes a montré un effet complexe des modulations de l'expression des gènes correspondants, la surexpression du gène HMA4 conduisant à une teneur en Zn de la graine similaire à celle du mutant perte de fonction. Ces résultats confirment l'importance de HMA4, et montrent la nécessité d'adapter la construction aux objectifs biotechnologiques visés. Afin de préciser le rôle de résidus conservés au sein de la famille des P1B-ATPases, j'ai étudié l'effet de l'expression d'un variant de HMA4 pour le domaine fortement conservé CPC. Les résultats obtenus in planta suggèrent une interaction avec la version native du transporteur entraînant une perte de l'activité de HMA4. Pour mener une approche structure/fonction sur ces transporteurs, L. lactis a été défini comme le meilleur candidat pour produire HMA3. Suite à l'expression de HMA3, un gain de tolérance au Cd a été observé et a permis de valider 3 variants de HMA3, mutés au niveau du pore ou du site d'hydrolyse de l'ATP, comme affectés dans l'activité de la protéine. Les membranes de L. lactis enrichies en transporteur HMA3 ou de ses variants ont permis une reconstitution in vitro en protéoliposomes permettant de mesurer une activité de transport du Cd compétitive avec le Zn et inhibée par le vanadate. / Work presented here is about Arabidopsis thaliana P1B-ATPases HMA2, HMA3 et HMA4, cation transporters found in different plant membranes. Cation content study of mutant plants hma2 and hma4 precised important role of HMA4 in upward translocation of Zn and Cd, and its high affinity for Cd. Cation content measure of seeds from different genotypes showed a complex effect of modulations of related genes expression levels, HMA4 overexpression leading to a seed Zn content similar the loss-of-function mutant one. These results confirm the importance of HMA4 and show the needs to adapt construction to biotechnological aims. To precise the role of residus conserved among the P1B-ATPases family, I studied the effect of the expression of a HMA4 variant for the highly conserved domain CPC. Obtained in planta results suggest an interaction with the native transporter leading to a loss of HMA4 activité. To perform a structure/function study on these transporters, L.lactis has been shown as the best candidate to produce HMA3. Due to HMA3 expression, a gain of Cd tolerance has been observed and allowed to validate three HMA3 variants, mutated in the pore or the ATP hydrolysis site, as affected in the protein activity. L.lactis membranes enriched with HMA3 or variants allowed an in vitro reconstitution in proteoliposomes and the measurement of a Cd transport activity competing with Zn and inhibited by vanadate.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013AIXM4025 |
| Date | 19 June 2013 |
| Creators | Cun, Pierre |
| Contributors | Aix-Marseille, Vavasseur, Alain |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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