L'application des techniques de séquençage à haut débit dans les dernières années a conduit à l'obtention de la séquence de génomes complets de plusieurs organismes. Le développement de nouveaux outils de génétique inverse était donc souhaitable afin de faire un usage optimal des données accumulées. Les nucléases hautement spécifiques représentent un outil unique pour induire des modifications ciblées du génome in vivo. L'induction d'une cassure double brin dans l'ADN est réparée soit par la voie de jonction d’extrémités nonhomologues soit par la voie très fidèle de la recombinaison homologue. Le ciblage d'un locus précis avec une nucléase spécifique stimule fortement la réparation de l'ADN, qui peut être utilisé pour induire des modifications ciblées dans le génome. Dans ma thèse, je vise à fournir une preuve de prinicipe pour l'utilisation des méganucléases et des transcription activator like effector nucléases (TALENs), deux classes communes de nucléases très spécifiques, comme nouveaux outils d'édition du génome chez le medaka, Oryzias latipes, et le poisson zèbre, Danio rerio. J'ai d’abord trouvé les conditions optimales d'utilisation de ces nucléases dans nos modèles de poissons. J'ai à cette occasion également développé une méthode très sensible et rapide pour la détection de modifications génomiques ciblées. J'ai ensuite induit des mutations au sein de trois gènes différents chez le poisson zèbre avec des TALENs. Les mutations dans le gène col6a1 ont conduit à la mise en évidence pour la première fois d’une technique de modification d’un site d’épissage d’un gène de poisson zèbre à l’aide d’une nucléase ciblée. Ce travail nous a permis d’établir une lignée de poisson avec une mutation dans le collagène VI alpha 1 qui est similaire à une mutation fréquemment trouvée chez les patients humains atteints de myopathie de Bethlem. De même, j’ai pu induire des mutations dans le gène nle1 du poisson zèbre qui vont permettre la mise en place de lignées de poissons mutants de ce gène. En outre, j'ai pu montrer qu’un nouveau type de nucléase, une TALEN Compact, était actif sur une cible chromosomique chez le poisson zèbre. En conclusion, les études que j'ai effectuées ont apporté la preuve de principe pour l'activité de TALENs et Compact TALENs ainsi que la première démonstration de modification de l'épissage à l’aide d’une TALEN chez le poisson zèbre et ont abouti à la mise en place d'une lignée de poisson dont le phénotype est proche d’un syndrome humain ouvrant la voie à la création de modèles pour d’autres mutations de ce type. Pour finir, je discute dans cette thèse des conditions permettant un usage le plus efficace des nucléases ciblées pour la génération de mutants et l’édition du génome. / The application of high throughput sequencing techniques in the recent years has led to obtaining the full genome sequences of many organisms. The development of novel tools for reverse genetics was thus desirable to make optimal use of the accumulated data. Site directed nucleases represent a unique platform to induce targeted genome modifications in vivo. Targeting a precise locus with a highly specific nuclease stimulates DNA repair, which can be harnessed for genome editing. Induction of a double strand break in DNA is repaired by either the error prone pathway of nonhomologous end joining or the high fidelity pathway of homologous recombination in the cell. Both mechanisms can be used to insert foreign DNA into the genome of the host. In my thesis, I aimed to provide proof of principle for the use of meganucleases and transcription activator like effector nucleases (TALENs), two common classes of site directed nucleases, as novel tools for genome editing in medaka, Oryzias latipes, and zebrafish, Danio rerio. During the first years of my thesis, I found the optimal conditions to use these nucleases in our fish models. I also developed a very sensitive and rapid method for detection of targeted genome modifications. I then induced mutations at three different endogenous loci in zebrafish with TALENs. The mutations in the col6a1 gene led to the first demonstration of splicing site modification in zebrafish using a TALE nuclease. This allowed the establishment of a fish line with a mutation in type VI collagen alpha 1 chain homologous to one mutation frequently found in human patients with Bethlem myopathy. Then I generated mutations in the nle1 gene which are heritable and from which establishment of mutant fish lines is in progress. In addition, by using the method for detection of targeted genome modifications I developed, I showed that a novel type of nuclease, a Compact TALEN, was active on a chromosomal target in zebrafish. In conclusion, the studies I performed provided proof of principle for the activity of TALENs and Compact TALENs as well as the first demonstration of TALEN-Mediated modification of splicing in zebrafish and resulted in the establishment of a fish line with mutated collagen VI. Induction of heritable mutations in the nle1 gene in zebrafish was also confirmed. Additionally, I proved that the choice of expression vector is crucial for the synthesis of active site directed nucleases for use in fish and established a novel efficient method for detection of targeted genomic mutations.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014PA112422 |
| Date | 19 December 2014 |
| Creators | Radev, Zlatko |
| Contributors | Paris 11, Joly, Jean-Stéphane |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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