L’édition du génome repose sur la création de cassures double brin à un endroit précis du génome à l’aide de nucléases artificielles (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) et sur les différents systèmes de réparation que la cellule va mettre en place pour réparer ces dommages. Les deux systèmes de réparation principaux sont le NHEJ (Non Homologous End Joining) et la RH (Recombinaison Homologue). Le NHEJ consiste en une ligation directe des extrémités de la coupure pouvant induire de petites insertions ou délétions avant la ligation. Ces mutations, si elles sont introduites dans un exon, vont modifier le cadre de lecture et pouvoir inactiver le gène cible (Knock Out). La RH permet la réparation de la cassure en recopiant les informations présentes sur la chromatide soeur. Si un ADN exogène comportant des homologies avec la séquence à réparer est inséré avec les nucléases artificielles, la cellule peut le prendre comme matrice de réparation, il est ainsi possible d’insérer n’importe quelle mutation ou transgène de manière précise (Knock In). Ici, différentes stratégies ont été développées pour optimiser ces approches d’édition du génome. Le couplage du domaine Nter de la protéine CtIP à la nucléase Cas9 permet d’augmenter le taux d’insertion par homologie d’un transgène au site de coupure. Le couplage de l’exonucléase Trex2 à la nucléase Cas9 nickase permet quant à lui d’augmenter le taux de mutation après coupure. Ces nouvelles approches peuvent être largement utilisées et permettent de faciliter l’édition du génome. / Genome editing relies on the ability of artificial nucleases (TALEN or CRISPR/Cas9 system) to induce double strand break into a precise and unique sequence in a whole genome and on the different DNA repair system. The two major DNA repair systems are NHEJ (Non Homologous End Joining) and HR (Homologous Recombination). NHEJ consists on DNA end direct ligation. This system can lead to deletion or insertion at the cut site. These mutations, when induced in an exon, can induce reading frame change and gene inactivation (Knock out). HR consists on the use of sister chromatid to copy lost information in order to complete the double strand break. If an exogenous DNA with homologies with the targeted DNA is inserted with artificial nucleases, it can be used as a template and can permit to introduce any transgene at the cut site (Knock In). In this work, different strategies were used to optimize genome editing. By fusing Nter part of CtIP to Cas9, the KI rate of an exogenous DNA is increased and by fusing Trex2 exonuclease to Cas9, the mutation rate induced is also increased. These two approaches can be widely used to improve genome editing strategies.

L'application des techniques de séquençage à haut débit dans les dernières années a conduit à l'obtention de la séquence de génomes complets de plusieurs organismes. Le développement de nouveaux outils de génétique inverse était donc souhaitable afin de faire un usage optimal des données accumulées. Les nucléases hautement spécifiques représentent un outil unique pour induire des modifications ciblées du génome in vivo. L'induction d'une cassure double brin dans l'ADN est réparée soit par la voie de jonction d’extrémités nonhomologues soit par la voie très fidèle de la recombinaison homologue. Le ciblage d'un locus précis avec une nucléase spécifique stimule fortement la réparation de l'ADN, qui peut être utilisé pour induire des modifications ciblées dans le génome. Dans ma thèse, je vise à fournir une preuve de prinicipe pour l'utilisation des méganucléases et des transcription activator like effector nucléases (TALENs), deux classes communes de nucléases très spécifiques, comme nouveaux outils d'édition du génome chez le medaka, Oryzias latipes, et le poisson zèbre, Danio rerio. J'ai d’abord trouvé les conditions optimales d'utilisation de ces nucléases dans nos modèles de poissons. J'ai à cette occasion également développé une méthode très sensible et rapide pour la détection de modifications génomiques ciblées. J'ai ensuite induit des mutations au sein de trois gènes différents chez le poisson zèbre avec des TALENs. Les mutations dans le gène col6a1 ont conduit à la mise en évidence pour la première fois d’une technique de modification d’un site d’épissage d’un gène de poisson zèbre à l’aide d’une nucléase ciblée. Ce travail nous a permis d’établir une lignée de poisson avec une mutation dans le collagène VI alpha 1 qui est similaire à une mutation fréquemment trouvée chez les patients humains atteints de myopathie de Bethlem. De même, j’ai pu induire des mutations dans le gène nle1 du poisson zèbre qui vont permettre la mise en place de lignées de poissons mutants de ce gène. En outre, j'ai pu montrer qu’un nouveau type de nucléase, une TALEN Compact, était actif sur une cible chromosomique chez le poisson zèbre. En conclusion, les études que j'ai effectuées ont apporté la preuve de principe pour l'activité de TALENs et Compact TALENs ainsi que la première démonstration de modification de l'épissage à l’aide d’une TALEN chez le poisson zèbre et ont abouti à la mise en place d'une lignée de poisson dont le phénotype est proche d’un syndrome humain ouvrant la voie à la création de modèles pour d’autres mutations de ce type. Pour finir, je discute dans cette thèse des conditions permettant un usage le plus efficace des nucléases ciblées pour la génération de mutants et l’édition du génome. / The application of high throughput sequencing techniques in the recent years has led to obtaining the full genome sequences of many organisms. The development of novel tools for reverse genetics was thus desirable to make optimal use of the accumulated data. Site directed nucleases represent a unique platform to induce targeted genome modifications in vivo. Targeting a precise locus with a highly specific nuclease stimulates DNA repair, which can be harnessed for genome editing. Induction of a double strand break in DNA is repaired by either the error prone pathway of nonhomologous end joining or the high fidelity pathway of homologous recombination in the cell. Both mechanisms can be used to insert foreign DNA into the genome of the host. In my thesis, I aimed to provide proof of principle for the use of meganucleases and transcription activator like effector nucleases (TALENs), two common classes of site directed nucleases, as novel tools for genome editing in medaka, Oryzias latipes, and zebrafish, Danio rerio. During the first years of my thesis, I found the optimal conditions to use these nucleases in our fish models. I also developed a very sensitive and rapid method for detection of targeted genome modifications. I then induced mutations at three different endogenous loci in zebrafish with TALENs. The mutations in the col6a1 gene led to the first demonstration of splicing site modification in zebrafish using a TALE nuclease. This allowed the establishment of a fish line with a mutation in type VI collagen alpha 1 chain homologous to one mutation frequently found in human patients with Bethlem myopathy. Then I generated mutations in the nle1 gene which are heritable and from which establishment of mutant fish lines is in progress. In addition, by using the method for detection of targeted genome modifications I developed, I showed that a novel type of nuclease, a Compact TALEN, was active on a chromosomal target in zebrafish. In conclusion, the studies I performed provided proof of principle for the activity of TALENs and Compact TALENs as well as the first demonstration of TALEN-Mediated modification of splicing in zebrafish and resulted in the establishment of a fish line with mutated collagen VI. Induction of heritable mutations in the nle1 gene in zebrafish was also confirmed. Additionally, I proved that the choice of expression vector is crucial for the synthesis of active site directed nucleases for use in fish and established a novel efficient method for detection of targeted genomic mutations.

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction. / Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner.

L’amélioration génétique du blé tendre (Triticum aestivum L.), une des trois céréales les plus cultivées, représente un intérêt stratégique pour la sécurité alimentaire de la population mondiale. Cette amélioration génétique va nécessiter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiologiques mis en jeu, et va aussi réclamer une efficacité accrue dans notre capacité à intervenir finement sur le génome. Les avancées majeures réalisées dans le domaine des biotechnologies ces dernières années permettent d’envisager de nouveaux champs d’action pour appréhender le fonctionnement des caractères d’intérêt agronomique du blé tendre, ainsi que pour son amélioration génétique, et fournissent également de nouveaux outils pour innover dans le domaine de l’édition des génomes. Nous avons cherché dans le cadre de cette thèse à développer des innovations chez blé tendre à partir de trois nouveaux outils issus des biotechnologies. Nous avons tout d’abord montré que l’extinction du gène pds par une stratégie de micro ARN artificiel à partir d’un micro ARN de riz permettait d’obtenir le phénotype attendu, et que l’expression du micro ARN artificiel était reliée à ce phénotype. Nous avons commencé à explorer la possibilité d’utiliser des microARN de blé pour réaliser la même extinction, sans résultat pour l’instant. Nous avons ensuite montré que des coupures spécifiques d’une séquence donnée peuvent être obtenues in vivo chez le blé tendre à l’aide d’une méganucléase, et que lorsque les sites de coupure encadrent une séquence donnée, une délétion du fragment encadré peut être obtenue. Nous avons enfin réalisé les premiers essais du système CRISPR-Cas9 au laboratoire et généré une lignée exprimant le transgène Cas9 de façon constitutive. Des résultats inattendus obtenus dans le cadre de ces expérimentations nous ont de plus permis d’améliorer le procédé de transformation génétique du blé tendre utilisé au laboratoire. Les applications de nos résultats pourront être utilisées pour des expérimentations de validation de gènes et de compréhension des mécanismes moléculaires associés, mais aussi à l’avenir pour intervenir directement et de plus en plus finement sur le génome du blé. Les choix stratégiques en termes de développement technologique et d’innovation dans le domaine des biotechnologies et dans le cadre des objectifs d’un laboratoire public sont discutés. / The genetic improvement of common wheat (Triticum aestivum L.), one of the three most cultivated cereals, is of strategic interest to the food security of the world's population. This genetic improvement will require a better understanding of the molecular and physiological mechanisms involved, and will also require increased efficiency in our ability to modify finely the genome. In recent years, the major advances in biotechnology have made it possible to envisage new fields of action for a deeply understanding of agronomic traits of wheat as well as for genetic improvement, and also provide new tools for innovate in the field of genome editing. In this PhD manuscript, we sought to develop innovations for wheat improvement using three new biotechnology tools. We first demonstrated that the extinction of the pds gene by a strategy of artificial micro RNA succeeded in the obtaining of the expected phenotype and that the expression of the artificial RNA was related to this phenotype. We have begun to explore the possibility of using wheat microRNAs to achieve the same extinction, with no results at this time. We have then shown that specific cuts of a given sequence can be obtained in vivo in wheat using a meganuclease, and that when the cleavage sites frame a given sequence a deletion of the framed fragment may be obtained. We finally carried out the first tests of the CRISPR-Cas9 system in the laboratory and generated a line expressing the Cas9 transgene constitutively. Unexpected results obtained during these experiments have also made it possible to improve the process of genetic transformation of soft wheat used in the laboratory. The applications of our results can be used for gene validation experiments and a better understanding of the molecular mechanisms involved, but also in the future for wheat genome editing. Strategic choices in terms of technological development and innovation in the field of biotechnology and within the framework of the objectives of a public laboratory are discussed.

Les études d’association pan-génomiques ont révélé plusieurs variants génétiques associés à des traits complexes. Les mesures érythrocytaires ont souvent fait l’objet de ce genre d’études, étant mesurées de façon routinière et précise. Comprendre comment les variations génétiques influencent ces phénotypes est primordial étant donné leur importance comme marqueurs cliniques et leur influence sur la sévérité de plusieurs maladies. En particulier, des niveaux élevés d’hémoglobine fœtal chez les patients atteints d’anémie falciforme est associé à une réduction des complications et une augmentation de l’espérance de vie. Néanmoins, la majorité des variants génétiques identifiés par ces études tombent à l’intérieur de régions génétiques non-codantes, augmentant la difficulté d’identifier des gènes causaux. L’objectif premier de ce projet est l’identification et la caractérisation de gènes influençant les traits complexes, et tout particulièrement les traits sanguins. Pour y arriver, j’ai tout d’abord développé une méthode permettant d’identifier et de tester l’effet de gènes knockouts sur les traits anthropométriques. Malgré un échantillon de grande taille, cette approche n’a révélé aucune association. Ensuite, j’ai caractérisé le méthylome et le transcriptome d’érythroblastes différentiés à partir de cellules souches hématopoïétiques et identifié plusieurs gènes potentiellement impliqués dans les programmes érythroïdes fœtaux et adultes. Par ailleurs, j’ai identifié plusieurs micro-ARNs montrant des motifs d’expression spécifiques entre les stages fœtaux et adultes et qui sont enrichis pour des cibles exprimées de façon opposée. Finalement, j’ai identifié plusieurs variants génétiques associés à l’expression de gènes dans les érythroblastes (eQTL). Cette étude a permis d’identifier des variants associés à l’expression du gène ATP2B4, qui encode le principal transporteur de calcium des érythrocytes. Ces variants, qui sont également associés à des traits sanguins et à la susceptibilité à la malaria, tombent dans un élément d’ADN spécifique aux cellules érythroïdes. La délétion de cet élément par le système CRISPR/Cas9 induit une forte diminution de l’expression du gène et une augmentation des niveaux de calcium intracellulaires. En conclusion, des échantillons de génotypages exhaustifs seront nécessaires pour étudier l’effet de gènes knockouts sur les traits complexes. Les érythroblastes montrent de grandes différences au niveau de leur méthylome et transcriptome entre les différents stages développementaux. Ces différences influencent potentiellement la régulation de l’hémoglobine fœtale et impliquent de nombreux micro-ARNs et régions régulatrices non-codantes. Finalement, l’exemple d’ATP2B4 montre qu’intégrer des études épigénomiques, transcriptomiques et des expériences d’édition de génome est une approche puissante pour caractériser des variants génétiques non-codants. Par ailleurs, ces résultats impliquent ATP2B4 dans l’hydratation des érythroblastes, qui est associé à la susceptibilité à la malaria et la sévérité de l’anémie falciforme. Cibler ATP2B4 de façon thérapeutique pourrait avoir un impact majeur sur ces maladies qui affectent des millions d’individus à travers le monde. / Genome-wide association studies (GWAS) have revealed several genetic variants associated with complex phenotypes. This is the case for red blood cell (RBC) traits, which are particularly amenable to GWAS as they are routinely and accurately measured. Understanding RBC trait variation is important given their significance as clinical markers and modifiers of disease severity. Notably, increased fetal hemoglobin (HbF) production in sickle cell disease (SCD) patients is associated with a higher life expectancy and decreased morbidity. Nonetheless, most variants identified through GWAS fall in non-coding regions of the human genome, increasing the difficulty of identifying causal links. The main goal of this project was to identify and characterize genes influencing complex traits, and in particular RBC phenotypes. First, I developed an approach to identify and test potential gene knockouts affecting anthropometric traits in a large sample from the general population, which did not yield significant associations. Then, I characterized the DNA methylome and transcriptome of erythroblasts differentiated ex vivo from hematopoietic progenitor stem cells (HPSC), and identified several genes potentially implicated in fetal and adult-stage erythroid programs. I also identified microRNAs (miRNA) that show specific developmental expression patterns and that are enriched in inversely expressed targets. Finally, I mapped expression quantitative trait loci (eQTL) in erythroblasts, and identify erythroid-specific eQTLs for ATP2B4, the main calcium ATPase of RBCs. These genetic variants are associated with RBC traits and malaria susceptibly, and overlap an erythroid-specific enhancer of ATP2B4. Deletion of this regulatory element using CRISPR/Cas9 experiments in human erythroid cells minimized ATP2B4 expression and increased intracellular calcium levels. In conclusion, large and comprehensive genotyping datasets will be necessary to test the role of rare gene knockouts on complex phenotypes. The transcriptomes and DNA methylomes of erythroblasts show substantial differences correlating with their developmental stages and that may be implicated in HbF production. These results also suggest a strong implication of erythroid enhancers and miRNAs in developmental stage specificity. Finally, characterizing the erythroid-specific enhancer of ATP2B4 suggest that integrating epigenomic, transcriptomic and gene editing experiments can be a powerful approach to characterize non-coding genetic variants. These results implicate ATP2B4 in erythroid cell hydration, which is associated with malaria susceptibility and SCD severity, suggesting that therapies targeting this gene could impact diseases affecting millions of individuals worldwide.