La recombinaison homologue (RH) est une réaction universelle qui assure la maintenance des génomes. Elle participe aussi à leur variabilité. De fait, dans les trois domaines du vivant elle est au centre de nombreux processus biologiques tels que la réparation des dommages à l'ADN ou encore le brassage génétique au cours de la méiose. Chez les bactéries, la RH est également impliquée dans les processus de transferts horizontaux qui favorisent les échanges génétiques entre les espèces. La transformation génétique est l'un de ces processus largement répandus parmi les bactéries. Celle-ci a spécifiquement lieu lorsque les cellules entrent dans un état physiologique particulier nommé la compétence. Comparativement aux autres types de transferts horizontaux, la transformation génétique à la caractéristique d'être entièrement contrôlée par la cellule receveuse qui dirige l'intégration d'ADN exogène capturé dans son milieu extérieur. Le but de ma thèse a été d'améliorer notre compréhension moléculaire de la voie de RH spécifique de la transformation génétique de Streptococcus pneumoniae qui permettrait à ce pathogène non seulement d'échapper aux vaccins mais également d'acquérir de nouvelles résistances aux antibiotiques. Bien qu'elle présente des variations d'un organisme à l'autre, la RH peut fondamentalement être décomposée en trois phases successives catalysées par la recombinase RecA chez les bactéries. La phase présynaptique consiste en la polymérisation de la recombinase sur l'ADN simple brin (sb) générant un nucléofilament. L'étape synaptique comprend l'appariement du nucléofilament avec celui des deux brins de la séquence homologue qui lui est complémentaire. Elle aboutit à l'apparition d'une D-loop, intermédiaire de recombinaison résultant de la jonction entre les deux molécules ADN engagées. Enfin, la phase postsynaptique constitue l'étape finale durant laquelle les jonctions entre les molécules ADN sont maturées puis clivées de manière à maintenir l'intégrité double brin du génome. L'action optimale de la recombinase au cours de ces trois étapes nécessite l'assistance de partenaires protéiques spécifiques au processus au sein duquel la réaction de RH intervient. Dans le cadre de la transformation génétique, la RMP (recombination mediator protein) DprA et la protéine de liaison à l'ADNsb SsbB sont deux partenaires de RecA spécifiquement produits par les cellules en état de compétence. Nous avons révélé in vitro que leurs actions conjuguées permettent d'améliorer l'efficacité de la RH catalysée par RecA en facilitant l'étape présynaptique de la réaction. De plus, nous avons montré que contrairement à SsbB, la protéine SsbA constitutive et essentielle ne stimule pas la RH spécifique de la transformation génétique de S. pneumoniae. Ce résultat suggère que les deux paralogues n'interviennent pas au cours des mêmes processus biologiques. La protéine RadA, ubiquitaire et très conservée parmi les bactéries, est un autre partenaire de RecA constitutivement produit par les cellules mais spécifiquement induit lors de la transformation génétique de S. pneumoniae. Par une combinaison d'approches in vivo, in vitro et structurale, nous avons mis en évidence d'une part, l'appartenance de RadA à la famille SF4 d'hélicases de type DnaB, et d'autre part son rôle clef dans la phase postsynaptique de la RH. Ce travail a permis de proposer un modèle inédit du mécanisme de migration de branches permettant la maturation des intermédiaires de recombinaison. Via son interaction avec RecA, nous proposons que RadA accède aux deux brins de l'ADN receveur de part et d'autre de la D-loop. Ainsi chargé symétriquement, RadA transloquerait de manière divergente le long des deux ADNsb dans le sens 5'-3' permettant ainsi l'ouverture du duplex receveur. L'incorporation de l'ADNsb envahissant serait ainsi facilitée par l'action de RadA tant au cours de la transformation génétique que des processus de maintenance faisant intervenir la RH / Homologous recombination (HR) is a central biological process in living organisms across all three domains of life. Crucial both for genomic maintenance and genetic plasticity, HR acts either to repair harmful DNA breaks or to produce new DNA combinations on chromosomes. In bacteria, HR is also used to exchange genetic material between different strains or species through horizontal gene transfers processes. Genetic transformation is one of those processes, widely distributed among species. Genetic transformation, occurring during a distinct physiological state called competence, is entirely directed by the recipient cell which uses exogenous DNA as a source of transferred genetic material. The goal of my PhD was to provide a molecular understanding of the specific HR pathway operating during the genetic transformation process of Streptococcus pneumoniae which enables this human pathogen to escape vaccine by capsular serotype switching as well as to acquire new antibiotics resistance genes. Although HR mechanisms vary among different organisms and cell types, the same three basic steps are conserved. During the pre-synaptic phase, the highly conserved recombinase named RecA in bacteria polymerises along ssDNA. The synaptic step proceeds through invasion of this nucleofilament into complementary duplex DNA, promoting the formation of joint molecules called D-loops. Finally, the post-synaptic phase corresponds to the maturation and clivage of thoses branched structures to preserve genomic integrity. To complete this strand exchange reaction, RecA requires the assistance of several specific partners depending on the context of the HR event. During genetic transformation, the recombination mediator protein DprA and the ssDNA binding protein SsbB are such partners specifically produced in the competence state. We have shown in vitro that their interplay with RecA improves HR efficiency by facilitating the pre-synaptic step of the reaction. Moreover, we have shown that, contrary to SsbB, the essential SsbA protein does not stimulate this specific HR reaction, suggesting that the two paralogous proteins could be implicated in different processes. The ubiquitous bacterial RadA in an other RecA partner constitutively produced by the cells and specifically induced during genetic transformation of S. pneumoniae. Using a combination of in vivo, in vitro and structural approaches, we have shown that RadA is a DnaB-like helicase implicated in the post-synaptic phase of HR. This structural and functional analysis of RadA leads to an unprecedented model of DNA branch migration acting to maturate D-loops structures. Through its interaction with RecA, RadA gains access to both strands of the recipient duplex DNA on both sides of the D-loop. Once symmetricaly loaded RadA could translocate divergently thereby unwinding the complementary duplex DNA thus facilitating the incorporation of ssDNA during genetic transformation as well as in genomic maintenance processes.

La rouille orangée du caféier causée par le champignon biotrophe Hemileia vastatrix (Berk et Br.) est la maladie la plus dévastatrice du caféier (Coffea arabica L.). La résistance à la rouille dans l'espèce allotétraploïde C. arabica semble jusqu'à présent conditionnée principalement par 9 facteurs de résistance majeurs (SH1-SH9), seuls ou en combinaison. Les variétés d'Arabica contenant le facteur de résistance SH3 introgressé d'une espèce de caféier sauvage (C. liberica) ont démontré une résistance durable au champ. L'objectif principal de ce travail était d'étudier l'organisation génomique, l'évolution et la diversité du locus SH3 chez le caféier et parallèlement de développer des outils permettant la validation fonctionnelle des gènes candidats pour la résistance à la rouille. Comme Une carte physique couvrant la région SH3 a tout d'abord été construite chez C. arabica et la position du locus de résistance a été délimitée dans un intervalle de 550 kb. La région a été séquencée chez trois génomes de caféier, Ea et Ca sous-génomes de C. arabica et Cc génome de C. canephora. L'analyse des séquences a révélé la présence d'un nombre variable de membres de la sous-classe CC-NBS-LRR ; ces gènes semblant être exclusivement présents à ce locus chez C. arabica. L'analyse génomique comparative indique que i) l'origine de la plupart des copies SH3-CNL est antérieure à la divergence entre les espèces de Coffea, ii) la copie ancestrale SH3-CNL a été insérée dans le locus SH3 après la divergence entre les Solanales et Rubiales. En outre, les mécanismes de duplication, délétion, conversion génique et de sélection positive semblent être les principales forces qui déterminent l'évolution des membres de la famille SH3-CNL. Différentes approches ont été entreprises pour le clonage des gènes candidats de résistance à la rouille. En parallèle, un protocole très efficace de transformation par Agrobacterium tumefaciens a été développé chez le caféier. Des plantes transgéniques contenant l'un des gènes R candidats ont été produites et acclimatées. Le bio-essai pour évaluer la résistance à H. vastatrix a été mis au point. La mise en place de protocoles efficaces pour le clonage des gènes de résistance et la transformation génétique ouvre la voie à la génomique fonctionnelle en routine chez le caféier. L'amélioration des connaissances sur la diversité des gènes de résistance à la rouille permettra l'optimisation des schémas de sélection pour la résistance durable à cette maladie majeure du caféier. / Coffee leaf rust (CLR) caused by the biotrophic fungus Hemileia vastatrix (Berk and Br.) is the most devastating disease of Arabica coffee (Coffea arabica). Resistance to CLR in its allotetraploid species appears so far conditioned primarily by 9 major resistance factors (SH1-SH9) either singly or in combination. Arabica varieties harboring the SH3 resistant factor introgressed from a wild coffee species (C. liberica) have demonstrated agronomical acceptable durable resistance in field conditions. The main objective of this work was to study the genomic organization, evolution and diversity of SH3 locus in coffee and in parallel to develop tools for functional gene validation of resistance candidate genes to CLR. As the first step, a physical map spanning the SH3 region in C. arabica was constructed and the position of the resistance locus was delimited within an interval of 550 kb. The region was completely sequenced in three coffee genomes, Ea and Ca subgenomes from C. arabica and Cc genome from C. canephora. Sequence analysis revealed the presence of a variable number of members CC subclass of NBS-LRR genes thatappeared to be exclusively present at this locus in C. arabica. Comparative genomic analysis indicated that i) the origin of most of the SH3-CNL copies predates the divergence between Coffea species ii) the ancestral SH3-CNL copy was inserted in the SH3 locus after the divergence between Solanales and Rubiales lineages. Furthermore, duplications, deletions, gene conversion and positive selection appeared as the main forces that drive SH3-CNL evolution. Different approaches have been undertaken to clone candidate genes to CLR. In parallel, a highly efficient and reliable Agrobacterium tumefaciens-mediated protocol was established for coffee. Transgenic plants containing one of the candidate gene were successful produced and acclimated into the greenhouse. The preliminary bioassay against H. vastatrix was achieved. The setting-up of efficient protocols for cloning resistance genes and for genetic transformation paves the way for routine functional genomics in coffee. The better knowledge on CLR resistance gene diversity would allow optimization of breeding schemes for durable resistance to this major coffee disease.

Les nombreux progrès en génie génétique ont mené au développement d’un nouveau système pour produire des molécules thérapeutiques : la moléculture végétale. L’intérêt de transformer des plantes en usine à molécules au service de l’Homme s’explique par les faibles coûts de production, la biosécurité et la capacité des plantes à synthétiser les protéines recombinantes présentant un repliement, une glycosylation et une activité appropriés. L’ablation florale constitue l’une des meilleures méthodes pour assurer le confinement génétique par stérilité mâle et femelle en plein champ. Avec objectif final de développer cette stratégie chez la luzerne (Medicago sativa), le promoteur MsMADS1 de la famille des MADS box a été isolé du génome de la luzerne et fusionné au gène rapporteur GUS et au gène codant pour la saporine, une protéine cytotoxique. Suite à la transformation génétique d’Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) à l’aide de diverses constructions, des plants transgéniques ont été générés et analysés. Des analyses d’expression transitoire ont aussi été effectuées pour évaluer l’expression du gène rapporteur GUS dans des cellules de luzerne par agro-infiltration des différentes constructions réalisées. Parallèlement, la marche génomique a été utilisée pour isoler et caractériser la séquence génomique du gène MsMADS1. La structure génomique du gène MsMADS1 semble inhabituelle avec un premier intron de plus de 1,9 kb et cette séquence ne présente pas d’homologie avec des séquences connues. Chez les plants transgéniques d’Arabidopsis, le promoteur MsMADS1 a permis l’expression de GUS de façon préférentielle dans les fleurs. Étonnamment, les constructions contenant le gène codant pour la saporine ont mené à l’obtention de plants transgéniques viables, dont le phénotype est identique aux plants sauvages d’Arabidopsis. / Progress in genetic engineering has led to the development of a new system to produce therapeutic molecules in plants: molecular pharming. The interest to transform plants into molecular factories for human purposes is explained by its lower cost, its biosecurity and the capacity of plants to synthesize recombinant proteins with appropriate folding, glycosylation and activity. Floral ablation represents one of the best ways to establish both male and female genetic confinement in open field conditions. With the final objective to develop this strategy in alfalfa (Medicago sativa), the promoter of a MADS box gene, MsMADS1, was isolated from the alfalfa genome. The genomic organisation of MsMADS1 appears to be unusual with a first intron longer than 1,9 kp without homology to any known sequence. This promoter was fused to the GUS reporter gene and a cytotoxic protein gene (saporin). Following Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) with various constructs, transgenic plants were regenerated and analysed. Transient expression was also assayed to evaluate GUS expression in alfalfa cells. Additional MsMADS1 genomic sequence was obtained by genome walking. In transgenic Arabidopsis, the MsMADS1 promoter allowed GUS expression preferentially in flowers. Surprisingly, saporin constructs resulted in the production of viable transgenic plants with a phenotype identical to wild Arabidopsis.

Dans cette étude, nous avons dans un premier temps adapte le protocole d'embryogenèse somatique primaire a différentes variétés d'hybrides porte-greffes (3309C, 110R, Fercal, 41B et SO4) en nous appuyant sur l'expérience acquise au laboratoire sur Vitis vinifera cv Chardonnay. Les résultats montrent que le génotype, le type d'explant (étamine, fleur ou nœud), le type et la dose d'auxine utilisés dans le milieu d’induction (2,4-D ou 2,4,5-T) ont une influence sur les efficacités d'embryogenèse somatique. En effet, pour le 3309C, l'utilisation du 2,4,5-T dans le milieu d'induction a montré une efficacité embryogène supérieure à partir de nœuds par rapport à celle obtenue à partir d'étamines. Cependant la meilleure efficacité a été obtenue à partir de fleurs de cette variété, sur un milieu d'induction contenant du 2,4-D. De plus, le protocole d'embryogenèse somatique secondaire utilise de manière récurrente au laboratoire nous a permis d'obtenir des masses embryogènes ainsi que des embryons somatiques secondaires de ces porte-greffes. Le protocole de conversion des embryons en plantes, en présence de 4,5 uM de cytokinine (BAP) s'est avère efficace pour le 11OR et le 41B. Dans un second temps, nous avons co-cultivé le matériel embryogène obtenu pour quatre de ces génotypes (110R, 3309C, Fercal et 41B), avec Agrobacterium tumefaciens contenant trois constructions génétiques : (i) une copie d'une séquence partielle (1020 pb) du gène de la coque protéique du virus en orientation sens; (ii) une partie courte en sens et en anti-sens (280 pb) de cette même séquence formant une structure en épingle a cheveux (hpRNA = hairpin RNA) ; (iii) un amiRNA ciblant une séquence virale. Le gène bactérien codant la néomycine phosphotransférase et conférant la résistance à un antibiotique, la kanamycine, a été utilisé comme gène de sélection. Les conditions de sélection a la kanamycine ont nécessité des adaptations expérimentales telles que l’ajustement de la concentration en antibiotique puisque la sélection avec 75 mg.L-1 de kanamycine s'avère insuffisamment drastique dans Ia plupart de nos expériences de co-cullture. Les résultats d'analyse moléculaire par PCR ont montré l'amplification probable des fragments d'intérêt (CPGFLV et amiRI1TA-71) dans des échantillons de 11OR et de 41B résistants à la kanamycine. Cependant des analyses moléculaires supplémentaires par AL-PCR ne nous ont pas renseignées sur une éventuelle intégration du transgène amiRATA-71 dans des masses embryogènes de 41B. / In this study, we initially adapted the protocol of primary somatic embryogenesis in different varieties of hybrid rootstocks (3309C, 110R, Fercal, 41B and SO4) building on the experience gained in the laboratory on Vitis vinifera cv Chardonnay. The results show that the genotype, the explant type (stamen, flower or node), the type and the dose of auxin used in the induction medium (2,4-D or 2,4,5-T) influence the efficiency of somatic embryogenesis. Indeed, for the 3309C, the use of 2,4,5-T in the induction medium showed a higher efficiency from embryogenic nodes compared to that obtained from stamens. However, the better efficiency was obtained from the flowers of this variety on an induction medium containing 2,4-D. In addition, a protocol used in the laboratory for secondary somatic embryogenesis allowed us to obtain embryogenic masses as well as secondary somatic embryos from these rootstocks. The protocol conversion of embryos into plants, in the presence of 4.5 [tM of cytokinin (BAP), was effective for the 110R and 41B. In a second step, we co-cultivated embryogenic material obtained for four of these genotypes (110R, 3309C, Fercal and 41B), with Agrobacteriwn tumefaciens containing three genetic constructs: (i) a copy of a partial sequence (1020 bp) of the coat protein gene of the virus in the sense orientation, (ii) a short part-way and antisense (280 bp) of the same sequence forming a hairpin structure (hairpin RNA = hpRNA) (iii) one amiRNA targeting a viral sequence. The nptll bacterial gene encoding neomycin phosphotransferase and conferring resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selection gene. The selection conditions to kanamycin have required experimental adaptations such as adjusting the concentration of antibiotic because the selection with 75 mg.L-1 of kanamycin was not enough drastic in most of our experiments of co-culture. The results of molecular analysis by PCR showed probable amplification of fragments of interest (CPGFLV and amiRNA-71) in samples of 11OR and 41B resistant to kanamycin. However, additional molecular analysis by AL-PCR did not inform us about a possible integration of the transgene amiRNA-71 in embryogenic masses of 41B.

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne peuvent provoquer des pertes de récolte importantes chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, comme le caféier (Coffea arabica). Dans ce travail, une variété de C. arabica (UFV 408-28) résistante à M. incognita a été identifiée et les réponses de résistance de la plante ont été caractérisées aux plans histologique et moléculaire. La résistance du génotype UFV 408-28 s’exprime par une réaction de type hypersensibilité (RH), avec mort cellulaire au site d’infection. L’infection par M. incognita est stoppée avant la formation des sites nourriciers. Chez la plante sensible (IAC15), le développement du nématode se poursuit jusqu’à la production d’oeufs dans les galles, le cycle complet durant environ 45 jours. L’étude comparative des réponses moléculaires des deux génotypes entre 4 et 6 jai montre une spécificité de l’expression des gènes associée à la RH ou à la sensibilité. Dans le génotype résistant, l’expression de gènes liés à la voie de résistance dépendante du acide salicylique, ou à la voie des composés phénylpropanoides, est particulièrement modifiée. L’identification de gènes impliqués dans l'expression de la résistance, et pouvant être utilisés comme marqueurs de sélection offre de nouvelles perspectives pour améliorer les variétés commerciales de café. En parallèle, la transformation génétique de C. arabica a été développée à l’aide du gène rapporteur uidA (GUS), permettant désormais d’envisager le transfert de gènes d’intérêt pour étudier leur rôle dans la résistance aux nématodes. / Os nematoides da galha do gênero Meloidogyne provocam perdas importantes na produção de numerosas plantas de interesse agronômico, como o cafeeiro (Coffea arabica). Neste trabalho foi identificado o acesso UFV 408-28 de C. arabica resistente à M. incognita e foram caracterizadas as respostas de resistência da planta nos níveis histológico e molecular. A resistência do genótipo UFV 408-28 se exprime por uma reação do tipo hipersensível (RH), com morte celular no local da infecção. A infecção por M. incognita é bloqueada antes de haver a formação de sítios de alimentação. Na planta suscetível (IAC15), o desenvolvimento do nematoide prossegue até a produção de ovos nas galhas, sendo que o ciclo se completa em aproximadamente 45 dias. O estudo comparativo das respostas moleculares dos dois genótipos entre 4 e 6 dias após infecção mostraram uma especificidade da expressão dos genes associados à RH ou à suscetibilidade. No genótipo resistente, a expressão de genes ligados à via de resistência dependente do ácido salicílico, ou à via dos compostos fenilpropanoides, é particularmente modificada. A identificação dos genes implicados na expressão da resistência pode ser utilizada no desenvolvimento de marcadores de seleção para o melhoramento de variedades comerciais de cafeeiro. Em paralelo, a transformação genética de C. arabica foi desenvolvida com o auxílio do gene repórter uidA (GUS), permitindo assim a possibilidade de transferência de genes para o estudo do seu respectivo envolvimento na resistência aos nematoides.

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne peuvent provoquer des pertes de récolte importantes chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, comme le caféier (Coffea arabica). Dans ce travail, une variété de C. arabica (UFV 408-28) résistante à M. incognita a été identifiée et les réponses de résistance de la plante ont été caractérisées aux plans histologique et moléculaire. La résistance du génotype UFV 408-28 s’exprime par une réaction de type hypersensibilité (RH), avec mort cellulaire au site d’infection. L’infection par M. incognita est stoppée avant la formation des sites nourriciers. Chez la plante sensible (IAC15), le développement du nématode se poursuit jusqu’à la production d’oeufs dans les galles, le cycle complet durant environ 45 jours. L’étude comparative des réponses moléculaires des deux génotypes entre 4 et 6 jai montre une spécificité de l’expression des gènes associée à la RH ou à la sensibilité. Dans le génotype résistant, l’expression de gènes liés à la voie de résistance dépendante du acide salicylique, ou à la voie des composés phénylpropanoides, est particulièrement modifiée. L’identification de gènes impliqués dans l'expression de la résistance, et pouvant être utilisés comme marqueurs de sélection offre de nouvelles perspectives pour améliorer les variétés commerciales de café. En parallèle, la transformation génétique de C. arabica a été développée à l’aide du gène rapporteur uidA (GUS), permettant désormais d’envisager le transfert de gènes d’intérêt pour étudier leur rôle dans la résistance aux nématodes. / Os nematoides da galha do gênero Meloidogyne provocam perdas importantes na produção de numerosas plantas de interesse agronômico, como o cafeeiro (Coffea arabica). Neste trabalho foi identificado o acesso UFV 408-28 de C. arabica resistente à M. incognita e foram caracterizadas as respostas de resistência da planta nos níveis histológico e molecular. A resistência do genótipo UFV 408-28 se exprime por uma reação do tipo hipersensível (RH), com morte celular no local da infecção. A infecção por M. incognita é bloqueada antes de haver a formação de sítios de alimentação. Na planta suscetível (IAC15), o desenvolvimento do nematoide prossegue até a produção de ovos nas galhas, sendo que o ciclo se completa em aproximadamente 45 dias. O estudo comparativo das respostas moleculares dos dois genótipos entre 4 e 6 dias após infecção mostraram uma especificidade da expressão dos genes associados à RH ou à suscetibilidade. No genótipo resistente, a expressão de genes ligados à via de resistência dependente do ácido salicílico, ou à via dos compostos fenilpropanoides, é particularmente modificada. A identificação dos genes implicados na expressão da resistência pode ser utilizada no desenvolvimento de marcadores de seleção para o melhoramento de variedades comerciais de cafeeiro. Em paralelo, a transformação genética de C. arabica foi desenvolvida com o auxílio do gene repórter uidA (GUS), permitindo assim a possibilidade de transferência de genes para o estudo do seu respectivo envolvimento na resistência aos nematoides.

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne peuvent provoquer des pertes de récolte importantes chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, comme le caféier (Coffea arabica). Dans ce travail, une variété de C. arabica (UFV 408-28) résistante à M. incognita a été identifiée et les réponses de résistance de la plante ont été caractérisées aux plans histologique et moléculaire. La résistance du génotype UFV 408-28 s’exprime par une réaction de type hypersensibilité (RH), avec mort cellulaire au site d’infection. L’infection par M. incognita est stoppée avant la formation des sites nourriciers. Chez la plante sensible (IAC15), le développement du nématode se poursuit jusqu’à la production d’oeufs dans les galles, le cycle complet durant environ 45 jours. L’étude comparative des réponses moléculaires des deux génotypes entre 4 et 6 jai montre une spécificité de l’expression des gènes associée à la RH ou à la sensibilité. Dans le génotype résistant, l’expression de gènes liés à la voie de résistance dépendante du acide salicylique, ou à la voie des composés phénylpropanoides, est particulièrement modifiée. L’identification de gènes impliqués dans l'expression de la résistance, et pouvant être utilisés comme marqueurs de sélection offre de nouvelles perspectives pour améliorer les variétés commerciales de café. En parallèle, la transformation génétique de C. arabica a été développée à l’aide du gène rapporteur uidA (GUS), permettant désormais d’envisager le transfert de gènes d’intérêt pour étudier leur rôle dans la résistance aux nématodes. / Os nematoides da galha do gênero Meloidogyne provocam perdas importantes na produção de numerosas plantas de interesse agronômico, como o cafeeiro (Coffea arabica). Neste trabalho foi identificado o acesso UFV 408-28 de C. arabica resistente à M. incognita e foram caracterizadas as respostas de resistência da planta nos níveis histológico e molecular. A resistência do genótipo UFV 408-28 se exprime por uma reação do tipo hipersensível (RH), com morte celular no local da infecção. A infecção por M. incognita é bloqueada antes de haver a formação de sítios de alimentação. Na planta suscetível (IAC15), o desenvolvimento do nematoide prossegue até a produção de ovos nas galhas, sendo que o ciclo se completa em aproximadamente 45 dias. O estudo comparativo das respostas moleculares dos dois genótipos entre 4 e 6 dias após infecção mostraram uma especificidade da expressão dos genes associados à RH ou à suscetibilidade. No genótipo resistente, a expressão de genes ligados à via de resistência dependente do ácido salicílico, ou à via dos compostos fenilpropanoides, é particularmente modificada. A identificação dos genes implicados na expressão da resistência pode ser utilizada no desenvolvimento de marcadores de seleção para o melhoramento de variedades comerciais de cafeeiro. Em paralelo, a transformação genética de C. arabica foi desenvolvida com o auxílio do gene repórter uidA (GUS), permitindo assim a possibilidade de transferência de genes para o estudo do seu respectivo envolvimento na resistência aos nematoides.

L'utilisation des plantes pour décontaminer les sols pollués par les métaux est une solution respectueuse de l'environnement. Mais le développement de cette technique à grande échelle est encore limité en raison de l'indisponibilité de plantes avec les caractéristiques souhaitées (hyperaccumulation, biomasse élevée et croissance rapide). Les objectifs de ce travail étaient d'évaluer le potentiel de plusieurs cultivars de Pélargonium odorants pour l'extraction du Pb au champ, étudier la disponibilité du plomb en relation avec l'activité rhizosphérique et développer un protocole de transformation génétique. Parmi les six cultivars de Pélargonium odorants testés au champ, trois : Attar of Roses, Clorinda et Atomic Snowflake ont accumulé plus de 1000 mg kg-1 Pb, avec une forte biomasse. Pendant les expérimentations en conditions contrôlées, Attar of roses (le cultivar hyperaccumulateur) acidifie sa rhizosphère et augmente la concentration en COD significativement plus par rapport Concolor Lace (le cultivar non hyperaccumulateur), sans doute en réponse à la pollution métallique. Les concentrations en plomb dans les deux cultivars sont corrélées avec l'extraction au CaCl2. Les analyses par EXAFS et ESEM-EDS ont montré que le plomb présent dans les racines était principalement sous forme de complexes organiques alors que les sulfates de plomb prédominent dans le sol. Parallèlement à ces essais, un protocole de transformation génétique a été mis au point en vue de mieux comprendre les processus biochimiques impliqués dans l'hyperaccumulation et la fonction des gènes, Le système de régénération optimisé se base sur la pré-culture d'explants sur un milieu contenant 10 μM TDZ + 1 mg L-1 de chacun de BAP et NAA suivie par l'enlèvement de TDZ du milieu de culture. La kanamycine et l'hygromycine se sont avérés être de bons marqueurs sélectifs pour le Pélargonium. Deux souches d'Agrobacterium, C58 et EHA105 contenant des vecteurs binaires avec des gènes marqueurs hpt et nptII ont été choisis pour des expériences de transformation. Ils ont également le gène codant uidA séquence du gène rapporteur. Après l'infection avec C58, 4 et 107 plantes enracinées sur hygromycine ont été obtenues pour Attar of Roses et Atomic Snowflake, respectivement. Parmi ces plantes enracinées, les quatre plantes d'Attar et 82 d'Atomic Snowflake ont exprimé le Gus dans les feuilles, pétioles, les tiges et les racines comme prévu avec une séquence sous contrôle du promoteur constitutif CaMV 35S. De 20 plantes qui expriment le Gus, 7 plantes se sont avérées être positives après criblage par PCR. Après infection par EHA105, 23 et 133 plantes enracinées ont été obtenues après sélection sur kanamycine, mais aucune n'a démontré d'activité GUS. Seule des expériences d'empreintes par Southern blotting permettront de corréler le nombre d'insertions et niveau de l'expression dans ces différents événements de transformation. / Metal removal from contaminated soils using plants can provide an environment friendly solution. However, its successful application on a large scale is still limited due to unavailability of plants with desired set of characteristics i.e. hyperaccumulation, high biomass and rapid growth. The objective of this work was to assess the potential of scented Pelargonium cultivars for lead (Pb) extraction under field conditions, plant induced rhizosphere changes, soil factors influencing availability of Pb and to develop an efficient genetic transformation protocol for the selected cultivars. Of the six scented Pelargonium cultivars field-tested, three cultivars (Attar of Roses, Clorinda and Atomic Snowflake) accumulated more than 1000 mg Pb kg-1 DW, with high biomass reaching up to 45 tons ha-1 y-1 dry matter. During assays in controlled conditions, Attar of roses (Pb hyperaccumulator) significantly acidified its rhizosphere and increased Dissolved Organic Carbon (DOC) concentration as compared to Concolor Lace (non-accumulator), probably due to enhanced exudation in response to the metal stress. Lead concentrations in both cultivars were best correlated with CaCl2 extracted Pb. Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) and Environmental Scanning Electron Microscopy-Energy Dispersive x-ray Spectroscopy (ESEM-EDS) demonstrated that Pb was mainly complexed to organic acids within plant tissues whereas the dominant form in soil was PbSO4. Parallel to the soil-plant Pb transfer assays, a genetic transformation protocol was optimized in view of better understanding biochemical processes involved in lead hyperaccumulation and gene function, in the future. The best regeneration scheme was based on the pre-culture of explants on 10 μM TDZ (Thidiazuron) in addition to 1 mg L-1 each of N6-benzylaminopurine (BAP) and α- naphthaleneacetic acid (NAA), followed by removal of TDZ from the culture medium. Kanamycin and hygromycin proved to be efficient selectable markers for genetic transformation. Two Agrobacterium strains, C58 and EHA105 harboring binary vectors carrying the selectable marker genes hpt and nptII were chosen for transformation experiments. They also contained the uidA gene coding sequence as reporter gene. After infecting with C58, 4 and 107 rooted plants on hygromycin-containing medium were obtained for Attar and Atomic cultivars, respectively. The four Attar plants and 82 Atomic plants expressed Gus in leaves, petioles, stems and roots as expected with a sequence driven by the 35S constitutive promoter. Polymerase Chain Reaction (PCR) screening was performed on Gus positive plants and 2 and 20 plants of Attar and Atomic were screened as PCR positive, respectively. After infection with EHA105, 23 and 133 rooted plants were obtained on kanamycin selection medium but none of these expressed Gus. Southern hybridization patterns will enable to correlate gene copy numbers to expression levels in these different events. The optimized protocols could be used for understanding molecular mechanisms of Pb accumulation and improvement in phytoextraction technique.

Résumé confidentiel / Not available

Streptococcus pneumoniae est la cause principale de pneumonies, otites, méningites et septicémies. La transformation génétique naturelle constitue l’élément clé de son adaptation aux changements environnementaux. Elle s’effectue par intégration d’ADN d’origine externe dans le chromosome de la bactérie, et a lieu pendant un état physiologique particulier appelé compétence.Mon travail de thèse a consisté à étudier les acteurs principaux de la régulation de la compétence (ComD, ComE) et les protéines impliquées dans la prise en charge, le traitement de l’ADN transformant et la recombinaison (DprA, RecA). J’ai notamment résolu la structure du facteur de transcription ComE par cristallographie aux rayons X, et réalisé une étude fonctionnelle de sa fixation sur un de ses promoteurs. Les résultats obtenus ont permis de proposer un mécanisme selon lequel la dimérisation induite par la phosphorylation de ComE, couplée à sa fixation sur la séquence promotrice d’ADN, provoquerait une courbure de l’ADN. Cette courbure permettrait la fixation de l’ARN polymérase, activant ainsi la transcription des gènes nécessaires à la mise en place de la compétence. / Streptococcus pneumoniae is the leading cause of community-acquired infections worldwide. The natural genetic transformation is the key to its adaptation to environmental changes. It takes place with the integration in its chromosome of exogenous DNA, during a physiological state called competence.During my thesis I have focused on the main actors of competence regulation (ComD, ComE) and on proteins involved in exogenous DNA processing and recombination (DprA, RecA). In particular, I have solved the structure of the transcriptional activator ComE by X-ray crystallography, and carried out a functional study of its binding to its promoter. The results obtained allowed us to propose a mechanism regarding the transcriptional activation by ComE of the genes necessary for the set up of the competence : the phosphorylation-induced dimerization, coupled to the binding of ComE to its DNA promoter, would curve the DNA and allow the binding of the RNA polymerase.