Dans cette étude, nous avons dans un premier temps adapte le protocole d'embryogenèse somatique primaire a différentes variétés d'hybrides porte-greffes (3309C, 110R, Fercal, 41B et SO4) en nous appuyant sur l'expérience acquise au laboratoire sur Vitis vinifera cv Chardonnay. Les résultats montrent que le génotype, le type d'explant (étamine, fleur ou nœud), le type et la dose d'auxine utilisés dans le milieu d’induction (2,4-D ou 2,4,5-T) ont une influence sur les efficacités d'embryogenèse somatique. En effet, pour le 3309C, l'utilisation du 2,4,5-T dans le milieu d'induction a montré une efficacité embryogène supérieure à partir de nœuds par rapport à celle obtenue à partir d'étamines. Cependant la meilleure efficacité a été obtenue à partir de fleurs de cette variété, sur un milieu d'induction contenant du 2,4-D. De plus, le protocole d'embryogenèse somatique secondaire utilise de manière récurrente au laboratoire nous a permis d'obtenir des masses embryogènes ainsi que des embryons somatiques secondaires de ces porte-greffes. Le protocole de conversion des embryons en plantes, en présence de 4,5 uM de cytokinine (BAP) s'est avère efficace pour le 11OR et le 41B. Dans un second temps, nous avons co-cultivé le matériel embryogène obtenu pour quatre de ces génotypes (110R, 3309C, Fercal et 41B), avec Agrobacterium tumefaciens contenant trois constructions génétiques : (i) une copie d'une séquence partielle (1020 pb) du gène de la coque protéique du virus en orientation sens; (ii) une partie courte en sens et en anti-sens (280 pb) de cette même séquence formant une structure en épingle a cheveux (hpRNA = hairpin RNA) ; (iii) un amiRNA ciblant une séquence virale. Le gène bactérien codant la néomycine phosphotransférase et conférant la résistance à un antibiotique, la kanamycine, a été utilisé comme gène de sélection. Les conditions de sélection a la kanamycine ont nécessité des adaptations expérimentales telles que l’ajustement de la concentration en antibiotique puisque la sélection avec 75 mg.L-1 de kanamycine s'avère insuffisamment drastique dans Ia plupart de nos expériences de co-cullture. Les résultats d'analyse moléculaire par PCR ont montré l'amplification probable des fragments d'intérêt (CPGFLV et amiRI1TA-71) dans des échantillons de 11OR et de 41B résistants à la kanamycine. Cependant des analyses moléculaires supplémentaires par AL-PCR ne nous ont pas renseignées sur une éventuelle intégration du transgène amiRATA-71 dans des masses embryogènes de 41B. / In this study, we initially adapted the protocol of primary somatic embryogenesis in different varieties of hybrid rootstocks (3309C, 110R, Fercal, 41B and SO4) building on the experience gained in the laboratory on Vitis vinifera cv Chardonnay. The results show that the genotype, the explant type (stamen, flower or node), the type and the dose of auxin used in the induction medium (2,4-D or 2,4,5-T) influence the efficiency of somatic embryogenesis. Indeed, for the 3309C, the use of 2,4,5-T in the induction medium showed a higher efficiency from embryogenic nodes compared to that obtained from stamens. However, the better efficiency was obtained from the flowers of this variety on an induction medium containing 2,4-D. In addition, a protocol used in the laboratory for secondary somatic embryogenesis allowed us to obtain embryogenic masses as well as secondary somatic embryos from these rootstocks. The protocol conversion of embryos into plants, in the presence of 4.5 [tM of cytokinin (BAP), was effective for the 110R and 41B. In a second step, we co-cultivated embryogenic material obtained for four of these genotypes (110R, 3309C, Fercal and 41B), with Agrobacteriwn tumefaciens containing three genetic constructs: (i) a copy of a partial sequence (1020 bp) of the coat protein gene of the virus in the sense orientation, (ii) a short part-way and antisense (280 bp) of the same sequence forming a hairpin structure (hairpin RNA = hpRNA) (iii) one amiRNA targeting a viral sequence. The nptll bacterial gene encoding neomycin phosphotransferase and conferring resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selection gene. The selection conditions to kanamycin have required experimental adaptations such as adjusting the concentration of antibiotic because the selection with 75 mg.L-1 of kanamycin was not enough drastic in most of our experiments of co-culture. The results of molecular analysis by PCR showed probable amplification of fragments of interest (CPGFLV and amiRNA-71) in samples of 11OR and 41B resistant to kanamycin. However, additional molecular analysis by AL-PCR did not inform us about a possible integration of the transgene amiRNA-71 in embryogenic masses of 41B.

Au cours des prochaines décennies, les besoins en bois vont entraîner une pression considérable sur la production forestière. Pour le Douglas (Pseudotsuga menziesii), deuxième essence utilisée pour le reboisement des forêts françaises, le développement et la diffusion de variétés améliorées par sélection classique est lente. Chez les conifères l’embryogenèse somatique, méthode de multiplication végétative la plus performante, a été développée avec succès. Cependant elle n’est obtenue à ce jour qu’à partir de matériel juvénile (graines) malgré les nombreux travaux engagés. Les objectifs de ce travail de thèse ont été de 1) caractériser à différentes échelles l’aptitude à l’embryogenèse somatique en comparant des masses embryogènes (ME) et des cals non-embryogènes (NE) isogéniques, 2) caractériser les marqueurs responsables de la variation du potentiel embryogène en comparant aux niveaux cellulaire et moléculaire, les ME primaires à des ME secondaires et tertiaires obtenues lors de la ré initiation de l’embryogenèse somatique à partir d’ES cotylédonaires. 1) Pour le premier objectif, nous avons rapproché des données de protéomique et de transcriptomique, que nous avons complétées par des observations biologiques (potentiel embryogène), histologiques, et biochimiques (teneur en eau, glucides, régulateurs de croissance). Nous avons observé chez les ME une surexpression des marqueurs impliqués dans la différenciation (hormones, facteurs de transcription) et la division cellulaire (évènements de mitose, teneur en glucides, information génétique). Nous avons retrouvé certains facteurs de transcription marqueurs de l’embryogenèse somatique : WOX, LEC1, SERK1, BBM. En comparaison, les NE sont caractérisés par la réponse aux stimuli (ABA, phénols, protection contre les ROS), mais aussi par le stockage de réserves carbonées (amidon). 2) Le potentiel embryogène des ME secondaires et tertiaires augmente significativement. Au niveau cellulaire, cela se traduit par une amélioration de la structuration des ES (diminution de centres polyembryogènes au profit d’ES isolés). Le rapprochement des données de protéomique et de transcriptomique ont mis en évidence que lors de cette reprogrammation cellulaire il y a surexpression du métabolisme des protéines, oxydatif, et hormonal. La présence de facteurs de transcription associés à la maturation de l’ES (WRKY, NAC, ARF, ERF et MYB) surexprimés précocement pourrait aussi être une caractéristique ciblant un plus fort potentiel embryogène chez le Douglas. Nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’aptitude à l’embryogenèse somatique du Douglas. Ils pourraient permettre in fine d’initier l’embryogenèse somatique à partir de matériel âgé. / Résumé anglais non communiqué

Hevea brasiliensis est une culture industrielle majeure pour la production de caoutchouc naturel (CN). La stimulation par l'éthéphon, un libérateur d'éthylène, est utilisée pour augmenter la production de latex en prolongeant son écoulement et en stimulant le métabolisme pour la régénération du latex. Cependant, le mécanisme d'action de l'éthylène n'est pas clairement élucidé chez l'hévéa. L'éthylène est un signal important qui régule le développement des plantes. Les facteurs de transcription AP2/ERF, et plus particulièrement les Ethylene Response Factors, jouent un rôle crucial dans le développement et la réponse aux stress biotiques et abiotiques chez les plantes. La production d'éthylène et sa signalisation sont aussi importantes en embryogenèse somatique et tout spécialement chez les espèces récalcitrantes à la culture in vitro.Dans cette étude, le transcriptome de référence a été amélioré par addition des fragments de séquence d'ARN issus de tissus reproducteurs lors d'un nouvel assemblage. Les 30.342 contigs ont été annotés par la base de données Gene Ontology. L'analyse des facteurs de transcription a permis d'identifier 2.448 contigs qui ont été classés en 58 familles de facteurs de transcription. Six pourcents de ces facteurs de transcription correspondent aux membres de la superfamille des AP2/ERF. L'accumulation de transcrits des gènes AP2/ERF a été analysée au cours du processus d'embryogenèse somatique chez des lignées de cal avec différents potentiels de régénération et dans différents tissus végétatifs et reproducteurs. L'analyse de l'abondance relative de transcrits dans les différents tissus montre que les ERFs des groupes I, VII et VIII sont fortement présents à tous les stades de l'embryogenèse somatique et dans les tissus immatures et matures de fleurs males et femelle, d'embryons zygotiques, de feuilles, d'écorce et de latex. Quarante gènes AP2/ERF représentent des marqueurs d'expression génique pour le potentiel de régénération de plantes de lignées de cal à différents stades du processus d'embryogenèse somatique. Quatorze marqueurs d'expression génique permettent même de prédire la capacité de régénération dès le stade de multiplication du cal. Cinquante-neuf marqueurs d'expression géniques sont spécifiquement exprimés dans les différents tissus de l'hévéa, et plusieurs AP2/ERFs ont les transcrits fortement accumulés dans le latex. La plupart des marqueurs de l'expression génique du latex appartient aux ERF du groupe VII. Les ERFs de ce groupe ont un motif conservé en N-terminal (MCGGAII), lequel est impliqué dans la voie N-end rule. Les analyses de localisation subcellulaire et de transactivation suggèrent que ces gènes HbERF-VII codent pour des facteurs de transcription fonctionnels potentiellement impliqués dans la réponse à l'hypoxie dans le latex. / Hevea brasiliensis is the major industrial crop for natural rubber (NR) production. Ethephon stimulation, an ethylene releaser, is used for increasing latex production by prolonging latex flow and stimulating the metabolism required for the latex regeneration. However, the mechanism of ethylene action is not clearly elucidated in this species. Ethylene is an important signal regulating the plant development. AP2/ERF transcription factors, and especially Ethylene-Response Factors, play a crucial role in plant development and response to biotic and abiotic stresses. Ethylene production and signalling are also important to somatic embryogenesis, especially for species that are recalcitrant in in vitro culture.In this study, a comprehensive Hevea transcriptome was improved using additional RNA reads from reproductive tissues in a new assembly. The 30,342 contigs were annotated in the Gene Ontology database. The analysis of transcription factors led to 2,448 contigs being identified, which were classed in 58 transcription factor families. Six percent of the transcription factors corresponded to members from the AP2/ERF superfamily. The transcript accumulation of AP2/ERF genes was analyzed during somatic embryogenesis for callus lines with different regeneration potential and in various vegetative and reproductive tissue of Hevea. The relative transcript abundance were studied and showed that ERFs from group I, VII and VIII were abundant at all stages of the somatic embryogenesis as well as, in both immature and mature male and female flowers, zygotic embryos, leaf, bark and latex. Forty genes were identified as expression marker for callus with different plant regeneration potential regeneration capacity. Interestingly, fourteen expression marker genes were found that be able to predict the regeneration capacity of callus at proliferating calli, the early stage of somatic embryogenesis process. Fifty-nine expression marker genes were found in the various plant tissues. Several AP2/ERF genes were shown highly transcript accumulation in latex and were assigned as latex expression marker genes. Almost of latex expression marker genes belong to the ERF group VII. Base on conserved motif analysis showed this ERF group contained the conserved N-terminal motif (MCGGAII) involved in the N-end rule pathway. Subcellular localization and transactivation analyses suggested that HbERF-VII candidate genes encoded functional transcription factors.

Chez le pin maritime l’embryogenèse somatique, méthode de multiplication végétative performante, n’est pas optimisée la limite étant le contrôle du développement des embryons somatiques (ES). Nos objectifs ont été 1) d’étudier les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires précoces contrôlant la différenciation des ES en réponse à une disponibilité en eau réduite 2) d’évaluer pour l'ES cotylédonaire de 12 semaines son état de maturité, son protéome afin de les comparer à l'embryon zygotique (EZ). 1) Pour le 1er objectif, le rapprochement de données de transcriptomique et de protéomique a été entrepris. Nous avons observé une réponse physiologique et moléculaire ABA-dépendante entrainant une transition précoce de la prolifération vers la différenciation des ES (surexpression de protéines impliquées dans la division cellulaire, l'embryogenèse et la synthèse de l'amidon). Une protéine de type germine et une ubiquitine ligase apparaissent comme marqueurs potentiels de l’embryogenèse somatique précoce du pin maritime, alors que la protéine phosphatase 2C marque la réponse adaptative à l’environnement de culture. 2) La maturité de l’ES cotylédonaire a été étudiée aux niveaux physiologiques (masse sèche, teneur en eau) et biochimiques (teneur en protéines totales, en sucres solubles). Des ES de 10, 12 ou 14 semaines se révèlent semblables. Une méthode de classification hiérarchique ascendante basée sur 9 variables explicatives, montre que l’ES est similaire à l’EZ cotylédonaire frais (protéomes présentant 94% d’homologie). Parmi les protéines communes, 3 familles ont été identifiées (protéines de réserve, protéines de réponse au stress HSP, protéines LEA) ainsi que l’aldose réductase et l’adénosine kinase. Nous les proposons comme marqueurs génériques du stade cotylédonaire de l'embryogenèse tardive du pin maritime. L’ensemble des résultats contribue à une meilleure compréhension de l’embryogenèse somatique du pin maritime. / In maritime pine somatic embryogenesis, a powerful method of vegetative propagation, is not optimized the limitation being the control of the somatic embryo (SE) development. Our objectives were 1) To study the early physiological, cellular and molecular mechanisms controlling SE differentiation in response to a reduced water availability 2) to estimate for cotyledonary SE 12 weeks old, its maturity, its proteome to compare them to the zygotique embryo (ZE). 1) For the 1st objective, transcriptomic and proteomic data were combined. We observed a physiological and molecular answer ABA-dependent, inducing an early transition from proliferation towards SE differentiation (surexpression of proteins involved in the cellular division, the embryogenesis and in starch synthesis). A protein of germin type and an ubiquitine ligase appear as potential markers of the early somatic embryogenesis of maritime pine, while the phosphatase protein 2C stands out the adaptive answer to the environment of culture. 2) Cotyledonary SE maturity was studied at the physiological (dry weight, water content) and biochemical levels (total protein content, soluble sugars). SE of 10, 12 or 14 weeks old appeared very similar. A hierarchical ascendant cluster analysis based on 9 explanatory variables, shows that SE is similar to the fresh cotyledonary EZ; proteome profiling further confirmed high similarity (94.5%) between them. Protein profiling revealed biomarkers belonging to 3 large families of proteins (HSP, LEA and storage proteins) or the aldose reductase and the adenosine kinase. We propose them as generic markers of the cotyledonary stage of the late embryogenesis of the maritime pine. All the results contribute to a better understanding of the somatic embryogenesis of maritime pine.

Chez le pin maritime l'embryogenèse somatique, méthode de multiplication végétative performante, n'est pas optimisée la limite étant le contrôle du développement des embryons somatiques (ES). Nos objectifs ont été 1) d'étudier les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires précoces contrôlant la différenciation des ES en réponse à une disponibilité en eau réduite 2) d'évaluer pour l'ES cotylédonaire de 12 semaines son état de maturité, son protéome afin de les comparer à l'embryon zygotique (EZ). 1) Pour le 1er objectif, le rapprochement de données de transcriptomique et de protéomique a été entrepris. Nous avons observé une réponse physiologique et moléculaire ABA-dépendante entrainant une transition précoce de la prolifération vers la différenciation des ES (surexpression de protéines impliquées dans la division cellulaire, l'embryogenèse et la synthèse de l'amidon). Une protéine de type germine et une ubiquitine ligase apparaissent comme marqueurs potentiels de l'embryogenèse somatique précoce du pin maritime, alors que la protéine phosphatase 2C marque la réponse adaptative à l'environnement de culture. 2) La maturité de l'ES cotylédonaire a été étudiée aux niveaux physiologiques (masse sèche, teneur en eau) et biochimiques (teneur en protéines totales, en sucres solubles). Des ES de 10, 12 ou 14 semaines se révèlent semblables. Une méthode de classification hiérarchique ascendante basée sur 9 variables explicatives, montre que l'ES est similaire à l'EZ cotylédonaire frais (protéomes présentant 94% d'homologie). Parmi les protéines communes, 3 familles ont été identifiées (protéines de réserve, protéines de réponse au stress HSP, protéines LEA) ainsi que l'aldose réductase et l'adénosine kinase. Nous les proposons comme marqueurs génériques du stade cotylédonaire de l'embryogenèse tardive du pin maritime. L'ensemble des résultats contribue à une meilleure compréhension de l'embryogenèse somatique du pin maritime.