Anticiper l’impact de fluctuations environnementales de nature climatique ou alimentaire est un enjeu crucial dans les systèmes de productions animales, et plus particulièrement sur la volaille. Cette influence de l’environnement sur les phénotypes passe en partie par des phénomènes épigénétiques, notamment la méthylation de l’ADN, et qui peuvent intervenir dans la régulation de l'expression des gènes. Ce sont des mécanismes qui n'affectent pas la séquence d'ADN mais qui peuvent être transmis par la mitose ou la méiose. Ces interactions entre épigénomes et expression des gènes sont de plus en plus étudiées dans les modèles animaux et chez les plantes. Cependant, les mécanismes de régulation de l'expression du génome par la méthylation de l’ADN sont assez peu connus chez les oiseaux. Ce travail de thèse repose sur deux dispositifs expérimentaux réalisés chez la poule, le but étant de caractériser le méthylome par séquençage haut-débit. Les profils de méthylation le long du génome, et le lien avec l’expression, sont établis d’abord par un séquençage tout-génome (WGBS) au sein d’embryons entiers, puis par un séquençage d'une sous-représentation du génome (RRBS) au sein d’hypothalamus d’individus adultes. À ce jour, aucune étude d'analyses de méthylome par RRBS chez la poule n'a été publiée. Ces deux analyses sont réalisées grâce au développement d'un pipeline bioinformatique, optimisé, disponible à la communauté scientifique. Globalement, le profil de méthylation chez la poule est similaire à ce qui est connu chez les mammifères : les îlots CpG - régions riches en dinucléotides CG, souvent peu méthylées, qui ponctuent le génome principalement dans les régions promotrices des gènes - sont globalement peu méthylés dans les promoteurs sur les données WGBS et RRBS. Les analyses du méthylome des embryons ont confirmé l'absence d'un phénomène de compensation de dose sur les chromosomes sexuels, ou la présence sur le chromosome Z d'une région hyperméthylée. Les analyses des données RRBS révèlent une hyperméthylation globale des CG sur le génome, suggérant une réponse de la méthylation à un stress environnemental. Sur les données WGBS, le niveau de méthylation dans le promoteur est négativement corrélé à l'expression du gène associé. Une méthylation allèle spécifique est également détectée entre les lignées, phénomène mis en évidence pour la première fois chez la poule et dont la fréquence est comparable à ce qui a été observé chez l'Homme. Sur les données RRBS, des résultats préliminaires de la réponse du méthylome aux stress environnementaux montrent le caractère complexe de cette relation. L’utilisation d’aliments moins énergétiques entraînerait une plus grande mobilisation des réserves lipidiques, tandis que les individus soumis à un stress à la chaleur ont un poids corporel plus léger. Une intégration de ces données à des mesures phénotypiques permettrait de faire le lien entre méthylation et environnement. Au-delà de l'aspect fondamental de cette thèse, l'application plus concrète de ces connaissances peut s'appliquer aux systèmes d'élevage pour obtenir des animaux mieux adaptés à l’environnement, en améliorant les caractères de production

Chez les mammifères, une centaine de gènes sont soumis à une régulation épigénétique où seule la copie maternelle, ou paternelle, est exprimée. Ce phénomène appelé empreinte parentale alimente encore différentes théories liées à la reproduction, notamment celles du conflit parental et de la coadaptation entre mère et enfant. Pw1/Peg3 est un gène d'empreinte paternellement exprimé. Cependant, à l'aide de deux modèles de souris bien distincts, une souris rapporteur (Pw1IRESnLacZ) et une nouvelle souris knockout pour Pw1/Peg3, nous avons détecté des transcrits Pw1/Peg3 maternels dans le cerveau périnatal. Plus précisément, nous avons mis en évidence une expression bi-allélique du gène rapporteur Pw1IRESnLacZ restreinte aux deux futures niches de cellules souches neurales adultes. In vitro, nous avons conclu, via des cultures primaires de cellules souches neurales, que l'expression bi-allélique endogène de Pw1/Peg3 est un évènement ponctuel rare. D'ailleurs lors de la caractérisation de notre modèle de souris Pw1/Peg3 knockout, nous avons observé un retard de croissance uniquement lors de la délétion de l'allèle Pw1/Peg3 paternel. Ce phénotype n'est pas lié à un problème de prise alimentaire chez les nouveaux-nés et contrairement à ce qui a été précédemment décrit, nous n'avons détecté aucun défaut de comportement maternel chez les femelles mutantes pour Pw1/Peg3. La lactation n'est pas non plus impactée par la délétion de Pw1/Peg3. Ces résultats démontrent que Pw1/Peg3 favorise intrinsèquement la croissance postnatale et que, désormais, ce gène d'empreinte ne peut plus être utilisé afin d'illustrer la théorie de coadaptation entre mère et enfant. / In mammals, a hundred of genes are preferentially expressed from one specific parental allele; a phenomenon referred as genomic imprinting. Establishing theories to explain the emergence of such a gene dosage strategy is challenging. Pw1/Peg3 is a paternally expressed gene. Using both a reporter mouse model and a novel constitutive knockout mouse model, we detected Pw1/Peg3 transcription from the maternal allele, which is normally silent, in the perinatal brain. Specifically, we observed that a putative Pw1/Peg3 bi-allelic expression is mainly restricted to the two future adult neural stem cells niches. In vitro experiments on primary neural stem cells allowed us to conclude that imprinting relaxation of the Pw1/Peg3 maternal allele is a rare event. Whether it affects the mouse phenotype is currently under investigation. In parallel, consistent with previously established mutant mouse models we confirmed that paternal Pw1/Peg3 deletion leads to growth retardation. However we did not find any impairment in maternal behaviors upon heterozygous or homozygous loss of Pw1/Peg3. Lactation was also not disrupted and mutant pups exhibited a normal suckling ability. Taken together, PW1/PEG3 promotes growth intrinsically and can no longer be used to illustrate the popular coadaptation theory between mother and infant.

Anticiper l’impact de fluctuations environnementales de nature climatique ou alimentaire est un enjeu crucial dans les systèmes de productions animales, et plus particulièrement sur la volaille. Cette influence de l’environnement sur les phénotypes passe en partie par des phénomènes épigénétiques, notamment la méthylation de l’ADN, et qui peuvent intervenir dans la régulation de l'expression des gènes. Ce sont des mécanismes qui n'affectent pas la séquence d'ADN mais qui peuvent être transmis par la mitose ou la méiose. Ces interactions entre épigénomes et expression des gènes sont de plus en plus étudiées dans les modèles animaux et chez les plantes. Cependant, les mécanismes de régulation de l'expression du génome par la méthylation de l’ADN sont assez peu connus chez les oiseaux. Ce travail de thèse repose sur deux dispositifs expérimentaux réalisés chez la poule, le but étant de caractériser le méthylome par séquençage haut-débit. Les profils de méthylation le long du génome, et le lien avec l’expression, sont établis d’abord par un séquençage tout-génome (WGBS) au sein d’embryons entiers, puis par un séquençage d'une sous-représentation du génome (RRBS) au sein d’hypothalamus d’individus adultes. À ce jour, aucune étude d'analyses de méthylome par RRBS chez la poule n'a été publiée. Ces deux analyses sont réalisées grâce au développement d'un pipeline bioinformatique, optimisé, disponible à la communauté scientifique. Globalement, le profil de méthylation chez la poule est similaire à ce qui est connu chez les mammifères : les îlots CpG - régions riches en dinucléotides CG, souvent peu méthylées, qui ponctuent le génome principalement dans les régions promotrices des gènes - sont globalement peu méthylés dans les promoteurs sur les données WGBS et RRBS. Les analyses du méthylome des embryons ont confirmé l'absence d'un phénomène de compensation de dose sur les chromosomes sexuels, ou la présence sur le chromosome Z d'une région hyperméthylée. Les analyses des données RRBS révèlent une hyperméthylation globale des CG sur le génome, suggérant une réponse de la méthylation à un stress environnemental. Sur les données WGBS, le niveau de méthylation dans le promoteur est négativement corrélé à l'expression du gène associé. Une méthylation allèle spécifique est également détectée entre les lignées, phénomène mis en évidence pour la première fois chez la poule et dont la fréquence est comparable à ce qui a été observé chez l'Homme. Sur les données RRBS, des résultats préliminaires de la réponse du méthylome aux stress environnementaux montrent le caractère complexe de cette relation. L’utilisation d’aliments moins énergétiques entraînerait une plus grande mobilisation des réserves lipidiques, tandis que les individus soumis à un stress à la chaleur ont un poids corporel plus léger. Une intégration de ces données à des mesures phénotypiques permettrait de faire le lien entre méthylation et environnement. Au-delà de l'aspect fondamental de cette thèse, l'application plus concrète de ces connaissances peut s'appliquer aux systèmes d'élevage pour obtenir des animaux mieux adaptés à l’environnement, en améliorant les caractères de production / Anticipating the impact of environmental changes (on climate and feed) is a crucial issue for livestock production systems, including poultry. The influence of the environment on phenotypes is partly mediated by epigenetic phenomena, including DNA methylation, which may be involved in the regulation of gene expression. These mechanisms do not affect the DNA sequence but can be inherited by mitosis or meiosis. The interactions between epigenomes and gene expression are increasingly being studied in animal models and in plants. However, the mechanisms of regulation of genome expression through DNA methylation are relatively unknown in birds. This thesis work is based on two experimental devices realized in chicken aiming to characterize the methylome by high-throughput sequencing. The methylation patterns across the genome, and their link with expression, were first established by whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) in whole embryos, following a reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) from hypothalamus of adults. To date, no specific chicken RRBS study has been published. These two analyses were carried out by developing an optimized bioinformatics pipeline, available for scientific community. Overall, the pattern of methylation in chicken is like those in mammals: CpG islands - dinucleotides CG-rich regions which are often poorly methylated, and which are found mainly in the promoter regions of the genome - are generally poorly methylated in promoters on WGBS and RRBS data. Embryo methylome analyses confirmed the absence of a dose-compensation phenomenon on sex chromosomes, or the presence of a hypermethylated region on the Z chromosome. The analyses of RRBS data revealed an overall hypermethylation of CGs across the genome, suggesting a methylation response to environmental stress. From the analysis of WGBS data, we found that the level of methylation in promoters was negatively correlated with the expression of the associated gene. For the first time, a specific allele methylation was also detected between chicken lines whose frequency is comparable to that observed in humans. On the RRBS data, preliminary results of the methylome response to environmental stresses showed the complex nature of this relationship. The use of a low-energy diet would led to greater mobilization of body fat, while individuals with heat stress had a lighter body weight. Integrating these data with phenotypic measurements would allow to link methylation and environment. Beyond the fundamental aspect of this thesis, the method developed in this work could be applied to livestock systems to breed animals better adapted to a changing environment, by improving production traits.

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction. / Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner.

Ce travail a porté sur l'étude d'une nouvelle méthode de détection électronique de biopolymères chargés<br />à l'interface solide/liquide en utilisant des réseaux de transistors à effet de champ. Les structures<br />utilisées sont des réseaux d'EOSFET. Ce type de structures semiconductrices opère avec une électrode<br />de référence et possède une surface active dont l'interface est du type électrolyte/oxyde/semi-conducteur.<br />Des micro- ou macro-gouttelettes de solutions contenant des biopolymères chargés sont déposées en des<br />endroits prédéfinis sur les réseaux de transistors. Ces dépôts locaux induisent des variations des caractéristiques<br />courant-tension des transistors ayant été exposés à l'apport de charge. L'étude des variations des<br />caractéristiques DC des transistors après l'adsorption de deux biopolymères de charges globales opposées<br />(la polylysine et l'ADN), ont montré des effets contraires qui correspondent bien à un apport de charges<br />positives pour la polylysine et négatives pour l'ADN. Des expériences de variations en concentration de<br />biopolymères ont permis de mettre en évidence une zone dynamique de détection correspondant à une<br />augmentation du signal électronique en fonction de la concentration en biopolymères déposés jusqu'à une<br />saturation attribuée à la quantité maximale de biopolymères pouvant être adsorbée à l'interface. Des<br />signaux parasites observés sur des tampons servant aux dilutions limitent la détection de basses concentration<br />en biopolymères. Des sensibilités de 10^7 monomères lysines/FET et de 4x10^8 bases d'ADN/FET<br />ont ainsi pu être estimées. Une modélisation de l'écrantage des charges d'interface par l'électrolyte de mesure permet de rendre compte des diminutions des signaux électroniques observés lorsque l'on augmente<br />progressivement la molarité en sel de l'électrolyte de mesure. La détection électronique de l'ADN a été<br />démontrée de manière reproductible pour de courts fragments d'ADN simple brin (oligonucléotides) ainsi<br />que pour des molécules d'ADN double brin issues de synthèses par PCR. En utilisant des ADN marqués<br />par des fluorophores, les signaux électroniques sont comparés avec des mesures de fluorescence locale. La<br />détection d'une mutation ponctuelle a pu être mise en évidence en combinant l'approche électronique<br />avec un protocole d'amplification d'ADN : "allèle spécifique PCR".