But : L’inflammation joue un rôle important dans la pathophysiologie de l’athérosclérose. Des marqueurs non spécifiques de l’inflammation tels que la Protéine C-Réactive (CRP) sont associés à un risque élevé de développer l’athérosclérose ou des complications aigues. Par sa capacité à se différencier en macrophage et à interagir avec différents types cellulaires, le monocyte joue un rôle essentiel dans l’athérogenèse. Afin de mieux caractériser le lien causal entre CRP et athérosclérose, nous avons étudié les effets de la CRP sur plusieurs aspects de la biologie du monocyte humain. Matériel et Méthodes : Les monocytes isolés du sang périphérique d’hommes jeunes (n=9) et de femmes pré ménopausées (n=9) en bonne santé ont été purifiés par gradient de Ficoll et sélection positive CD14, mis en culture pendant une nuit puis exposés à la CRP purifiée (25 µg/ml) pendant 12 ou 24 h. Une puce à oligonucléotides réalisée à façon par nos soins et contenant 250 gènes a permis d’effectuer le profilage de l’expression génique des monocytes traités ou non par la CRP. Les variations d’expression de certains gènes ont été confirmées par PCR quantitative et western blot. Résultats et Discussion : Nos résultats montrent que la CRP augmente l’expression des cytokines proinflammatoires IL-1 et IL-6, et des chimiokines IL-8 et Gro-beta. En revanche, la CRP diminue l’expression des MIP-1alpha, MIP-1beta et de l’alpha 2 macroglobuline. De plus, nous rapportons ici pour la première fois que la CRP augmente l’expression génique du récepteur nucléaire Liver X Receptor (LXR) alpha, facteur de transcription dont le rôle dans l’athérosclérose n’a été que récemment suggéré. Par western blot, nous montrons que l’augmentation d’expression du LXR alpha est suivie de sa translocation nucléaire. En conclusion, cette thèse montre que la CRP exerce à la fois des effets pro- et antiinflammatoires sur les monocytes humains ex-vivo. Nos résultats sont en faveur d’un rôle anti-athérogénique de la CRP de part son effet précédemment inconnu sur le LXR alpha. / Object : Inflammation plays an important role in the pathophysiology of atherosclerosis. Non specific inflammation biomarkers, such as C-Reactive Protein (CRP), are associated with a higher risk of developing atherosclerosis or other acute complications. By its capacity to differentiate into macrophages and to interact with other cells monocytes play a key role in atherogenesis. In order to better understand the causal link between CRP and atherosclerosis, we studied the effects of CRP on several aspects of human monocyte biology. Material and methods : Monocytes isolated from peripheral blood of healthy men (n=9) and healthy premenopausal women (n=9), were purified by Ficoll and CD14 positive selection, cultured over night then exposed to purified CRP (25 µg/ml) for 12 or 24h. A custom-made oligonucleotide array of 250 genes was used to analyse gene expression profiles of monocytes exposed or not to CRP. Changes in gene expression were confirmed by quantitative PCR and western blot. Results and Discussion : Our results show CRP increased pro-inflammatory cytokine (IL-1 and IL-6) and chemokine (IL-8 and Gro-beta) expression. In contrast, CRP decreased MIP-1 alpha, MIP-1 beta and alpha-2 macro-globuline expression. Furthermore, we were able to report, for the first time, that CRP increased gene expression of Liver X receptor (LXR) alpha, a transcription factor whose role in atherosclerosis has only recently been shown. Using western blot, we showed that the increased LXR alpha gene expression was followed by its nuclear translocation. In conclusion, this thesis suggests that CRP may have both pro and anti-inflammatory effects on the human monocyte ex-vivo. Our results argue in favor of an anti-atherogenic role of CRP, at least in part by its new effect on LXR alpha.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 juillet 2023) / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la plus fréquente des dystrophies musculaires chez l'adulte avec une prévalence de 1/8,000. Il s'agit d'une maladie multisystémique qui touche non seulement le muscle, mais aussi de nombreux organes et systèmes comme le cœur, le cerveau, les poumons, les yeux, les systèmes endocrinien et digestif. Une particularité de cette maladie est l'existence de la forme congénitale sévère responsable de 20 % de décès. La DM1 est causée par une expansion d'un triplet CTG dans la région 3' non codante du gène DMPK et que les ARNs mutés s'accumulent dans les noyaux formant des foci nucléaires. Ces foci séquestrent un facteur d'épissage de la famille des protéines muscle blind (MBNL) et perturbent la fonction de CUGBP-Elav-like (CELF), conduisant à une dérégulation de l'épissage alternatif et à des symptômes cliniques. La DM1 est une maladie qui affecte la qualité de vie, conduit à l'invalidité et réduit l'espérance de vie des sujets atteints, et actuellement il n'existe aucun traitement curatif. Notre hypothèse stipule que la destruction des ARNm DMPK mutés par l'utilisation des oligonucléotides antisens (ASOs) empêchera la fixation du MBNL, et améliorera ainsi le phénotype DM1 dans des modèles in vitro et in vivo. La première partie de ma thèse consiste à développer un modèle cellulaire de la DM1. Nous avons d'abord élaboré une procédure standardisée pour dériver les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) à partir de lignées cellulaires lymphoblastiques (LCL) en utilisant la méthode Sendeï. Nous avons généré des hiPSCs d'un homme atteint de la forme adulte de la DM1 avec 200 répétitions CTG. Les hiPSCs obtenues conservent la mutation génétique de la DM1, présentent un caryotype normal, expriment les marqueurs de pluripotence et sont capables de se différencier en trois couches germinales. Par la suite, nous avons développé un modèle de cellules neuronales humaines de patients DM1 ayant 1300 CTG pour vérifier l'efficacité des ASOs. Les cellules neuronales récapitulent les principaux phénotypes moléculaires de la DM1 par la présence de foci nucléaires qui se co-localisent avec les protéines MBNL1 et MBNL2 et l'existence des défauts d'épissage alternatif. La deuxième partie est consacrée à améliorer l'efficacité des ASOs pour le traitement des manifestations musculaires, cardiaques et cérébrales en étudiant l'ASO IONIS-486178 conjugué à un acide palmitique via un linker HA (C16-HA): le IONIS-877864. Nos résultats montrent que C16-HA améliore considérablement l'absorption des ASOs dans les muscles striés des souris DMSXL après administration systémique. L'injection sous-cutanée de IONIS-877864 entraîne une destruction de 92 % des ARNm de hDMPK mutés dans les muscles squelettiques et de 78 % dans le cœur. Toutefois, aucun effet n'a été observé dans le cerveau. La diminution des transcrits mutés de hDMPK dans les muscles squelettiques causée par IONIS-877864 a été associée à une amélioration significative de la force musculaire, confirmant ainsi la pertinence des ASOs conjugués à l'acide palmitique C16-HA pour le traitement aussi bien des tissus musculaires que cardiaques. Dans la troisième partie du travail, nous testons l'administration intrathécale des ASOs comme traitement des déficits cérébraux observés chez les patients DM1, étant donné qu'aucune chimie à ce jour n'a été capable de franchir la barrière hémato-encéphalique. IONIS-486178 a été évalué à la fois in vitro dans les cellules neurales DM1 et in vivo chez les souris DMSXL. L'ASO a détruit 80 % des foci nucléaires dans les cellules neurales. Cette destruction a permis la redistribution de MBNL1 et 2 et la correction de certaines anomalies d'épissage. L'injection intracérébroventriculaire de IONIS-486178 chez des souris DMSXL adultes a permis une diminution de jusqu'à 70 % des ARNm de hDMPK mutés dans les différentes régions du cerveau, un effet maintenu pendant douze semaines, et une biodistribution de l'ASO dans toutes les régions cérébrales. Enfin, l'analyse de l'activité globale des souris DMSXL par le test Open field montre qu'une seule injection intracérébroventriculaire des souris DMSXL néonatales par IONIS-486178 améliore significativement les anomalies comportementales 3 semaines après le traitement. Dans l'ensemble, cette thèse soutient la faisabilité d'un traitement par injections systémiques d'ASO pour les manifestations musculaires et cardiaques, et par administration intrathécale pour le traitement des déficits cérébraux chez les patients DM1. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most common muscular dystrophy in adults with a prevalence of 1/8,000. It is a multisystem disease that affects not only the muscle, but also many organs and systems such as the heart, brain, lungs, eyes, endocrine and digestive systems. A particularity of this disease is the existence of the severe congenital form responsible for 20 % of deaths. DM1 is caused by an expansion of a CTG triplet in the 3' non-coding region of the DMPK gene and the mutated RNAs accumulate in the nuclei forming nuclear foci. These foci sequester a splicing factor of the muscle blind protein family (MBNL) and disrupt CUGBP-Elav-like (CELF) function, leading to deregulation of alternative splicing and clinical symptoms. DM1 is a disease that affects quality of life, leads to disability, and reduces life expectancy of affected individuals and currently there is no curative treatment. Our hypothesis states that the destruction of mutated DMPK mRNAs using antisense oligonucleotides (ASOs) will prevent MBNL binding, and thus improve the DM1 phenotype in in vitro and in vivo models. The first part of my thesis consists in developing a cellular model of DM1. We first developed a standardized procedure to derive human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from lymphoblastic cell lines (LCL) using the Sendeï method. We generated hiPSCs from a man affected by an adult form of DM1 with 200 CTG repeats. The resulting hiPSCs retained the DM1 genetic mutation, had a normal karyotype, expressed pluripotency markers and were able to differentiate into three germ layers. Subsequently, we developed a human neuronal cell model of DM1 patients with 1300 CTG to verify the efficacy of ASOs. The neuronal cells recapitulate the main molecular phenotypes of DM1 by the presence of nuclear foci that co-localize with MBNL1 and MBNL2 proteins and the existence of alternative splicing defects. The second part is devoted to improving the potency of ASOs for the treatment of muscle, heart and brain events by studying the IONIS-486178 ASO conjugated to a palmitic acid (C16) via an HA linker (the IONIS-877864). Our results show that C16-HA significantly enhances ASO uptake in striated muscles of DMSXL mice after systemic administration. Subcutaneous injection of IONIS-877864 results in 92 % destruction of mutant hDMPK mRNAs in skeletal muscle and 78 % in heart. However, no effect was observed in the brain. The decrease in mutant hDMPK transcripts in skeletal muscles caused by IONIS-877864 was associated with a significant improvement in muscle strength, thus confirming the suitability of C16-HA palmitic acid-conjugated ASOs for the treatment of both muscle and cardiac tissues. In the third part of the work, we test intrathecal administration of ASOs as a treatment for brain deficits observed in DM1 patients, as no chemistry to date has been able to cross the blood-brain barrier. IONIS-486178 was evaluated both in vitro in DM1 neuronal cells and in vivo in DMSXL mice. ASO destroyed 80 % of nuclear foci in neural cells. This destruction allowed the redistribution of MBNL1 and 2, and the correction of some splicing defects. Intracerebroventricular injection of the IONIS-486178 in DMSXL mice adult resulted in a decrease of up to 70 % in hDMPK mutated mRNA levels in different brain regions, an effect maintained for twelve weeks, and biodistribution of ASO in all brain regions. Finally, analysis of the global activity of DMSXL mice by the Open field test shows that a single intracerebroventricular injection of neonatal DMSXL mice with IONIS-486178 significantly improves behavioral abnormalities 3 weeks after treatment. Overall, this thesis supports the feasibility of treatment with systemic injections of ASO for muscle and cardiac manifestations, and intrathecal administration for the treatment of brain deficits in DM1 patients.

Le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) implique l’utilisation d’un système de livraison musculaire efficace. L’évaluation d’oligonucléotides antisens (ASO) en conformation gapmer nous a permis d’identifier deux ASO, un de chimie 2’-O-méthoxyéthyle et l’autre avec des acides nucléiques bicycliques avec éthyle contraint, dont l’efficacité dans les modèles cellulaires et de souris de la DM1 était suffisante pour réduire significativement l’ARNm étendu de la DMPK. Il fut possible d’observer une réduction des foci nucléaires menant à une redistribution d’un régulateur d’épissage séquestré au noyau, ainsi corrigeant des erreurs d’épissage caractéristiques de la DM1. Plus particulièrement chez la souris DMSXL, l’injection systémique bihebdomadaire a mené à une maturation des fibres musculaires ainsi qu’au rétablissement de la force musculaire des sujets. Ce projet est la preuve de principe in vitro et in vivo qu’une thérapie génique par les ASO est concevable pour le traitement de la DM1. / A gene therapy for myotonic dystrophy type 1 (DM1) implies an effective muscular delivery method. The evaluation of antisenses oligonucleotides (ASO) enabled us to identify two gapmer ASOs, one with a 2’-O-methoxyethyl chemisty and the other with a constrained ethyl bicyclic nucleic acid, whose efficacy in DM1 cell and mouse models was sufficient to significantly reduced expanded hDMPK mRNA levels. Furthermore, reduction in DMPK induced nuclear foci resulted in redistribution of a sequestered alternative splicing regulator, leading to correction of mis-splicing events characteristic of DM1. In DMSXL mouse, biweekly systemic injection of ASOs induced muscle fiber maturation and a gain in forelimb strength. This project is the in vitro and in vivo proof of the principle that an ASO gene therapy is conceivable for treatment of DM1.

Dans le cadre de ce travail, nous avons synthétisé, isolé et caractérisé de nouvelles molécules amphiphiles dérivées d’acides nucléiques. Les modifications de ces structures ont été réalisées par voie chimique au moyen d’une réaction de chimie clic, la réaction de Huisgen. Les amphiphiles développés peuvent être classés dans deux catégories différentes : - Les amphiphiles de faible masse moléculaire qui dérivent de nucléosides et de glycosylnucléosides. Les propriétés d’auto organisation de ces composés ont été étudiées par différentes techniques, notamment de microscopie électronique et de diffraction des rayons X. La capacité de ces amphiphiles à former des gels a été évaluée dans différents solvants (eau et solvants organiques). Les propriétés de complexation des acides nucléiques de ces molécules ont également été mises en évidence. Les premiers résultats de transfection montrent que les glycosylnucléosides amphiphiles permettent l’internalisation des oligonucléotides à visée thérapeutique dans des cellules humaines de carcinome hépatocellulaire (Huh 7) en présence de sérum. - Les amphiphiles de masse moléculaire élevée qui dérivent d’oligonucléotides. La formation d’agrégats a été mise en évidence par différentes techniques telles que la microscopie électronique et la diffusion de la lumière. Les propriétés de reconnaissance associées à la séquence oligonucléotide ont été étudiées par des expériences de thermodénaturation. L’auto vectorisation de ces composés a pu être observée par microscopie d’épi-fluorescence et confocale. Cette auto vectorisation a également pu être quantifiée par cytométrie en flux sur une gamme variée de types cellulaires humains tels que les cellules épithéliales (Hela T4), les cellules gastriques (NCI) ou encore les cellules de carcinome hépatocellulaire (Huh-7). Ces travaux présentent également pour la première fois l’évaluation in cellulo d’oligonucléotides amphiphiles ciblant le virus de l’hépatite C. / *

Le traitement et le diagnostic de maladies d'origine génétique suscite un grand intérêt à l'heure actuelle. De par leur spécificité d'appariement avec les acides nucléiques, les oligonucléotides possèdent un grand potentiel dans ce domaine. Ils se heurtent toutefois à des limitations majeures, dont leur faible stabilité en milieu physiologique et la difficulté qu'ils ont à franchir les membranes biologiques. De nombreuses équipes de recherche s'intéressent, afin de pallier ces limitations, à la conception et à la synthèse d'oligonucléotides chimiquement modifiés. Parmi ceux-ci, les Locked Nucleic Acids (LNA), présentant une modification qui consiste en l'insertion d'un pont −O−CH2− entre l'atome C2' et l'atome C4' du sucre, constituent une famille qui semble posséder les propriétés requises. Ils sont considérés comme des candidats très prometteurs en tant qu’agents thérapeutiques et qu’outils de diagnostic du génome. La caractérisation de la stabilité et de la sélectivité d'appariement entre les LNA et les acides nucléiques naturels est, dans ce contexte, important.<p><p>Dans ce travail, nous avons étudié la stabilité, la sélectivité d'appariement ainsi que la dynamique de la structure double brin d'un oligonucléotide hybride LNA-DNA, et nous avons comparé ces propriétés à celles d'un oligonucléotide DNA-DNA de même séquence. Ce dernier est constitué de 11 paires de bases formées par l'appariement du brin 5'-GCGTGTGTGCG-3' avec le brin 3'-CGCACACACGC-5'. Dans le cas de l'hybride, les nucléotides du second brin sont tous remplacés par des LNA.<p><p>La stabilité a été étudiée expérimentalement par différentes techniques :spectroscopie d'absorption UV, calorimétrie différentielle à balayage, résonance magnétique nucléaire et calorimétrie à titrage isotherme. Ces études montrent que la stabilité du duplexe hybride est plus importante que celle du naturel, et que ce phénomène s'explique par un terme entropique plus favorable pour la formation du duplexe LNA-DNA que pour la formation du duplexe DNA-DNA.<p><p>La sélectivité d'appariement a été étudiée en comparant la stabilité des deux oligonucléotides étudiés avec celle d'oligonucléotides présentant un mésappariement dans la séquence. Nos résultats montrent que la sélectivité d'appariement du brin LNA n'est pas significativement différente de celle du brin DNA. Ce résultat ne doit cependant pas être généralisé car nous n'avons testé qu'une position centrale pour le mésappariement.<p><p>L'étude de la dynamique de la structure des oligonucléotides a été effectuée par RMN et porte sur la caractérisation de la cinétique de l'ouverture individuelle des paires de bases. Nous observons que la durée de vie de l'état fermé des paires de bases G-C est supérieure dans l'oligonucléotide LNA-DNA, tandis que l'état fermé des paires A-T semble posséder une durée de vie supérieure dans l'oligonucléotide DNA-DNA.<p><p>Au cours de ce travail de thèse nous avons pu caractériser les facteurs énergétiques à la base de la stabilité accrue des oligonucléotides chimiquement modifiés de type LNA. Nous avons montré que leur sélectivité d’appariement n’est pas toujours supérieure à celle des oligonucléotides naturels et dépend des séquences impliquées. Enfin, nous avons mis en évidence les différences entre la dynamique de la structure d’un oligonucléotide possédant des LNA et celle d’un duplexe DNA. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La PARP-1 est une enzyme modulaire très conservée, dont la structure comprend: 1) un domaine amino-terminal de liaison à l'ADN (DBD), contenant un signal de localisation nucléaire et trois doigts de zinc Znl, Zn2 et le Zn3 récemment découverts, ces trois doigts agissent comme détecteur moléculaire de cassures dans l'ADN; 2) un domaine régulateur central contenant un motif BRCT et des sites accepteurs de poly (ADP-ribose) permettant d'inactiver la PARP-1 (réaction d'automodification) ; et 3) un domaine carboxy-terminal catalytique renfermant le site actif. Dans notre étude, après avoir clone différentes protéines recombinantes par PCR, nous avons fait des essais de poly (ADP) ribosylation sur des extraits crus des cellules. En outre, nous avons fait des essais de retardement sur gel (EMSA) avec des oligonucleotides pour évaluer les interactions des peptides, correspondants aux fragments du domaine DBD, avec ces oligonucleotides afin d'essayer d'expliquer le mode d'activation de l'enzyme.

Les antennes collectrices d'énergie lumineuse du système photosynthétique sont constituées d'un grand nombre de pigments collecteurs de photons. L'extraordinaire efficacité de migration d'un état excité le long de ces pigments est attribuée à leur orientation parallèle et à leur positionnement favorable au sein des complexes collecteurs. Cet arrangement, contrôlé par des interactions faibles entre pigments et polypeptides, prend la forme de 3 anneaux qui constituent les antennes collectrices d'énergie lumineuse. <br />Dans le but d'organiser des porphyrines dans l'espace de façon similaire au système naturel, un squelette oligonucléotidique a été choisi pour l'élaboration de nanosystèmes multi-porphyriniques. C'est dans cette optique que nous avons réalisé la synthèse d'oligodeoxynucléotides fonctionnalisés par des porphyrines. La préparation de ces systèmes est fondée sur l'oligomérisation en O-3'et O-5' d'un dérivé de la 2'-deoxyuridine fonctionnalisé par une porphyrine. L'architecture de ces systèmes a été dessinée sur la base de liaisons rigides et souples. Dans le but d'imposer par la conformation de la chaîne oligonucléotidique une organisation parallèle aux porphyrines, ces dernières sont greffées en C-5 de l'uracile par un espaceur rigide et les uridines reliées entre elles par une liaison souple. Un mono-, un di-, un tetra- et un octa-deoxynucléotides à porphyrines pendantes ont notamment été synthétisés. <br />Un agencement approprié des porphyrines base-libre et métallées au Zn(II) au sein du fil moléculaire oligonucléotidique a permis de mettre en évidence un transfert d'énergie de l'état excité de la porphyrine de Zn(II) vers les porphyrines base-libre. On observe une nette contribution de la porphyrine de Zn(II) à l'émission des porphyrines base-libre. <br />La série des oligonucléotides a été métallée au Zn(II) dans le but d'examiner l'effet du degré d'oligomérisation de ces architectures moléculaires sur leur capacité de complexation de bases bidendates telle que le DABCO. Nous avons pu montrer que la coordination de DABCO est favorisée au fur et à mesure de l'élévation du degré d'oligomérisation grâce à la pré-organisation conformationnelle qui s'instaure au sein du squelette oligonucléotidique.<br />Enfin, nous nous sommes intéressés à l'auto-assemblage par liaisons hydrogène que peut établir la base nucléique uracile avec un synton complémentaire telle que la triazine fonctionnalisée par des porphyrines. Des études quantitatives de stabilisation des architectures supramoléculaires ont mis en évidence des interactions intermoléculaires secondaires de type p-p entre les porphyrines au sein du complexe supramoléculaire formé.

De nombreuses études ont montré l'intérêt thérapeutique de molécules dérivant des microARN (inhibiteurs ou analogues) en cancérologie. Cependant avant d'espérer en faire de futurs médicaments, il est indispensable d'élaborer des systèmes permettant leur délivrance préférentielle dans les cellules cancéreuses. Dans ce travail, nous avons développé deux plateformes innovantes basées sur les microARN : la première utilise les propriétés optiques des quantum dots (QD) et est destinée à l'imagerie des microARN ; la seconde repose sur la sérum albumine humaine (SAH) et a une finalité de délivrance ciblée de microARN. La mise en place de ces plateformes a nécessité la synthèse d'une petite chimiothèque de bioconjugués lipidiques dérivés des microARN (inhibiteurs ou analogues), le but étant d'exploiter l'effet hydrophobe pour les fixer à la surface des QD (ancrage hydrophobe dans la paroi lipidique des QD) et de la SAH (interaction avec les sites de liaison aux acides gras). Dans les deux cas, différentes études incluant des caractérisations physico-chimiques (MET, DLS), des expériences in vitro (SPR) et in cellulo (microscopie de fluorescence, criblage fonctionnel, RTqPCR) ont montré la potentialité de ces nouvelles plateformes. / Exploitation of gene-silencing is a very promising strategy in human therapeutics. Several engineered small non coding RNAs (inhibitors or mimics) are already in preclinical and clinical trials. However a key impediment to the wider success of these approaches remains the specific delivery of RNA-derived molecules into cancerous cells. This work aimed at developing two innovative microRNA-based plateforms : the first one relying on quantum dots (QD) is dedicated to microRNA imaging and the second one based on human serum albumin (HSA) represents a new targeted delivery system. The implementation of both plateforms required the synthesis of a small library of microRNA derived lipidic bioconjugates (inhibitors or mimics), the aim being to exploit the hydrophobic effect for their loading on QD (hydrophobic anchoring in the hydrophobic QD surface) and on HSA (interaction with fatty acid binding sites). In both cases, different studies including physico-chemical caracterizations (TEM, DLS), in vitro (SPR) and in cellulo experiments (fluorescence microscopy, functional screening, RTqPCR) demonstrated the great promises held by these new plateforms.

Pseudomonas aeruginosa (PA) représente un véritable problème de santé publique étant l'une des principales causes d'infections nosocomiales et de mortalité chez les patients atteints de fibrose cystique. Cette bactérie provoque des pathologies respiratoires chroniques qui persistent malgré une thérapie antibiotique agressive à cause de l'émergence de souches résistantes et de la formation du biofilm. Une stratégie prometteuse consiste à inhiber les facteurs de virulence de PA tels que PA-IL qui est une lectine soluble impliquée dans la reconnaissance des résidus galactose et qui semble jouer un rôle dans l'adhésion de la bactérie au glycocalyx autour de la cellule hôte ainsi que dans le développement du biofilm. Alors que les interactions lectine-carbohydrate sont caractérisées par une spécificité élevée, l'affinité entre les lectines et les saccharides simples est faible et une présentation multivalente des unités saccharidiques est généralement requise pour atteindre une interaction significative d'un point de vue physiologique. Ce manuscrit décrit la synthèse de glycooligonucléotides dont l'affinité envers PA-IL a été étudiées par DNA Direct Immobilisation microarray. Les blocs de construction saccharidiques ont été assemblés sur des échafaudages phosphorylés en utilisant une combinaison de synthèse en phase solide d'ADN et « click chemistry » (cycloaddition 1,3-dipolaire azide/alcyne). Grâce à la technologie glycoarray, les glycomimétiques ont été analysés à une échelle nanomolaire. Les résultats expérimentaux ont permis d'établir des relations structure-activités précises. En outre, des études des docking ont confirmé les résultats expérimentaux. La synthèse des candidats les plus affins envers PA-IL a été conduite sans l'étiquette d'ADN et à plus grande échelle pour vérifier par des analyses biologiques leurs propriétés anti-adhésives ou inhibitrices du biofilm. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a major public health issue due to its impact on nosocomial infections as well as its impact on cystic fibrosis patient mortality. It often leads to chronic respiratory infection despite aggressive antibiotic therapy due to the emergence of resistant strains and to the formation of biofilm. A promising approach is to inhibit the virulence factors of PA such as PA-IL which is a soluble lectin implicated in the recognition of galactose residues that seems to be involved in the adhesion of the bacterium to the glycocalyx surrounding host's cells as well as in the biofilm development.If carbohydrate-lectin interactions proceed with high specificity, the affinity between lectins and simple saccharides is low and a multivalent display of saccharidic units is generally required to attain physiologically significant association. This manuscript reports the synthesis of high affinity glycooligonucleotides toward PA-IL for its inhibition and their bindings properties were studied on a DNA direct immobilisation microarray. Glycoside building blocks were assembled on phosphorylated scaffolds using a combination of DNA solid phase synthesis and microwave assisted « click chemistry » (copper (I) catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition). Thanks to glycoarray technology the glycomimetics were studied at the nanomole scale. The experimental results have been used to assess structure binding relationships. In addition, docking studies have confirmed ours experimental results. The synthesis of the best hits as anti-biofilm or anti-adhesive molecules have been synthesized at upper scale without their DNA tag for biological studies as anti-adhesive compounds and biofilm inhibitors of PA.

Les oligonucléotides antisens et leurs analogues, tels que les Peptide Nucleic Acids (PNA), ont la capacité d'inhiber ou de moduler l'expression d'un gène cible, de manière spécifique de séquence. Leur utilisation pour des applications thérapeutiques est cependant limitée par leur faible internalisation cellulaire ou leur mauvaise localisation intracellulaire, etnécessite le développement de stratégies efficaces de vectorisation. La Riboflavine, ou vitamine B2, est une vitamine essentielle qui a les caractéristiques requises pour être potentiellement utilisée en tant qu'agent ciblant de vectorisation. Le travail accompli au cours de ce projet de thèse a permis de démontrer la capacité de deux dérivés de la Riboflavine, la Flavine et le Lumichrome, à induire une internalisation par endocytose de PNA conjugués, dans plusieurs lignées cellulaires. En outre, un phénomène d'internalisation photochimique induit par la Rhodamine a été mis en évidence avec des double-conjugués Flavine ou Lumichrome - PNA - Rhodamine et conduit à une sortie efficace des endosomes de ces conjugués. Ce travail de thèse a donc permis de caractériser un conjugué trifonctionnel pour l'internalisation et lalibération cytoplasmique de molécules bioactives. / Antisense oligonucleotides and analogs, such as Peptide Nucleic Acids (PNA), are valuable tools to inhibit or modulate gene expression in a sequence-specific manner. Their successful application for therapeutic purposes is however hampered by poor cellular uptake or incorrect intracellular localization, and requires the development of efficient delivery strategies.Riboflavin, or vitamin B2, is an essential vitamin that could potentially be used as a targeting delivery ligand. We demonstrate in this PhD work the ability of two Riboflavin derivatives, Flavin and Lumichrome, to promote endocytosis-mediated internalization of PNA conjugates in several cell lines. Furthermore, a phenomenon of Photochemical Internalization produced by Rhodamine has been characterized using Flavin or Lumichrome - PNA - Rhodamine conjugatesand is responsible for an efficient release of these conjugates from endosomes. This PhD work has thus led to the characterization of a trifunctional conjugate for the internalization and cytoplasmic delivery of bioactive molecules.