Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les rétrovirus appartiennent à une famille de virus où les protéines virales sont codées par un transcrit sens pleine longueur suite à un épissage alternatif. Récemment, notre équipe a contribué à démontrer pour la première fois la présence d'une transcription antisens chez le rétrovirus HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus). Ce transcrit antisens épissé a été caractérisé et semble être initié dans le LTR 3' (Long Terminal Repeat), permettant ainsi la production d'une nouvelle protéine virale, nommée HBZ (HTLV-1 bZIP factor). Cette dernière est une protéine nucléaire et a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. Aussi, nous avons découvert et caractérisé des transcrits antisens chez HTLV-2, HTLV-3, HTLV-4 et VIH-l (Virus d'Immunodéficience Humaine). Ce projet de maîtrise avait pour objectif de caractériser les nouvelles protéines APH-3 et APH-4 codées par les transcrits antisens de HTLV-3 et HTLV-4 respectivement. Il s'agissait donc d'étudier leur localisation ainsi que leurs fonctions dans la réplication rétrovirale. D'abord, une comparaison de séquence avec HBZ a permis d'identifier deux régions basiques ainsi qu'un motif « bZIP-like ». Des études de localisation cellulaire de ces protéines ont ensuite été réalisées par microscopie confocale. Ainsi, nous avons démontré que APH-3 et APH4 apparaissent nucléaires, sous la forme de granules et, dans le cas d'APH-3 partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ et la nucléoline. Par la suite, des mutants de délétion dépourvus des motifs BR2, BR1 et DBD ont permis de conclure que APH-3 et APH-4 contrairement à HBZ délété se rendent au noyau. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur luciférase précédé d'un promoteur de collagénase (site AP-l), ont démontré que ces deux protéines contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants de délétions ont démontré que le motif « leucine zipper » atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. Toutefois, une étude utilisant ces mutants de délétions et un gène rapporteur contenant le LTR 5' de HTLV-1 ont suggéré que le motif « leucine zipper » atypique ne semble pas être impliqué dans l'inhibition de la trans-activation par Tax. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que les transcrit antisens de HTLV-3 et HTLV-4 sont traduits tout comme chez d'autres rétrovirus. Ces protéines jouent d'importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ. Ces études ont permis d'approfondir la biologie moléculaire concernant la famille des rétrovirus et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives dans ce domaine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : APH, rétrovirus, HTLV, transcription antisens, HBZ, Jun, Tax.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez les rétrovirus, la production des protéines virales dépend de l'expression d'un transcrit sens pleine longueur, initié dans le LTR5' et épissé de façon alternative. Des études ont récemment mis en évidence l'existence d'un nouveau type de transcrit antisens, initié dans le LTR3' de certains rétrovirus humains (VIH-1 et HTLV-1). Chez le virus HTLV-1, plusieurs études ont permis l'identification de deux formes d'épissage du transcrit antisens ainsi que la caractérisation d'une nouvelle protéine virale, nommée HBZ (HTLV-1 bZIP factor). Cette protéine se localise au noyau et régule négativement la transcription virale en interagissant avec des facteurs de transcription contenant un motif leucine zipper. Cette étude a pour objectif de caractériser la transcription antisens des rétrovirus humains HTLV-2, HTLV-3 et HTLV-4. Des études de RT-PCR ont permis de détecter un transcrit antisens chez des cellules 293T transfectées par l'ADN proviral des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4. Le séquençage des signaux obtenus a confirmé la présence d'épissage dans chacun des transcrits étudiés. Des sites d'initiation de la transcription ont pu être identifiés par des analyses de 5' RACE sur un clone du virus HTLV-2. Un site fonctionnel de polyadénylation a été identifié chez un clone de ces trois rétrovirus. La comparaison des séquences de la protéine HBZ et des ORF antisens des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4 démontre que le motif leucine zipper ne semble pas présent chez ces derniers. Dans le but de permettre l'expression et la détection des protéines antisens, les parties codantes des transcrits antisens des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4 ont été clonées dans un vecteur d'expression contenant une étiquette Myc. L'analyse des cellules transfectées par microscopie confocale a permis de détecter la protéine antisens de HTLV-3 (APH-3) à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme ainsi que les protéines antisens de HTLV-2 et -4 (APH-2 et APH-4) majoritairement dans le noyau. La co-transfection des vecteurs d'expressions de APH-2, APH-3 et APH-4 en présence des vecteurs exprimant les protéines virales Tax1, Tax2 ou Tax3 en plus du vecteur contenant le LTR de HTLV-1 ou de HTLV-2 en amont du gène de la luciférase dans des cellules 293T, a permis de mettre en évidence une inhibition de l'activation de la transcription virale dépendante de Tax par ces nouvelles protéines antisens. Finalement, afin de caractériser l'activité promotrice antisens de ces rétrovirus, le gène rapporteur de la luciférase a été inséré dans les deuxièmes exons de APH-3 et APH-4, compris dans les vecteurs contenant la portion 3' des génomes proviraux de HTLV-3 et -4. La transfection de ces constructions dans des cellules lymphocytaires humaines (Jurkat E6.1), suivie d'une stimulation par une série d'agents activateurs de ces dernières, a permis d'observer une modulation de la transcription antisens. Ces recherches portant sur la transcription antisens des rétrovirus humains ont permis de mettre en évidence que les transcrits antisens des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4 ont la capacité de coder pour des nouvelles protéines virales. Les analyses de séquences effectuées ainsi que les observations en microscopie confocale laissent croire que ces protéines pourraient jouer des rôles différents de ceux précédemment attribués à la protéine HBZ. De plus amples études seront nécessaires afin d'identifier les rôles de ces protéines nouvellement découvertes dans le cycle de réplication viral. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : APH, Rétrovirus, HTLV, Transcription antisens, HBZ.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 juillet 2023) / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la plus fréquente des dystrophies musculaires chez l'adulte avec une prévalence de 1/8,000. Il s'agit d'une maladie multisystémique qui touche non seulement le muscle, mais aussi de nombreux organes et systèmes comme le cœur, le cerveau, les poumons, les yeux, les systèmes endocrinien et digestif. Une particularité de cette maladie est l'existence de la forme congénitale sévère responsable de 20 % de décès. La DM1 est causée par une expansion d'un triplet CTG dans la région 3' non codante du gène DMPK et que les ARNs mutés s'accumulent dans les noyaux formant des foci nucléaires. Ces foci séquestrent un facteur d'épissage de la famille des protéines muscle blind (MBNL) et perturbent la fonction de CUGBP-Elav-like (CELF), conduisant à une dérégulation de l'épissage alternatif et à des symptômes cliniques. La DM1 est une maladie qui affecte la qualité de vie, conduit à l'invalidité et réduit l'espérance de vie des sujets atteints, et actuellement il n'existe aucun traitement curatif. Notre hypothèse stipule que la destruction des ARNm DMPK mutés par l'utilisation des oligonucléotides antisens (ASOs) empêchera la fixation du MBNL, et améliorera ainsi le phénotype DM1 dans des modèles in vitro et in vivo. La première partie de ma thèse consiste à développer un modèle cellulaire de la DM1. Nous avons d'abord élaboré une procédure standardisée pour dériver les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) à partir de lignées cellulaires lymphoblastiques (LCL) en utilisant la méthode Sendeï. Nous avons généré des hiPSCs d'un homme atteint de la forme adulte de la DM1 avec 200 répétitions CTG. Les hiPSCs obtenues conservent la mutation génétique de la DM1, présentent un caryotype normal, expriment les marqueurs de pluripotence et sont capables de se différencier en trois couches germinales. Par la suite, nous avons développé un modèle de cellules neuronales humaines de patients DM1 ayant 1300 CTG pour vérifier l'efficacité des ASOs. Les cellules neuronales récapitulent les principaux phénotypes moléculaires de la DM1 par la présence de foci nucléaires qui se co-localisent avec les protéines MBNL1 et MBNL2 et l'existence des défauts d'épissage alternatif. La deuxième partie est consacrée à améliorer l'efficacité des ASOs pour le traitement des manifestations musculaires, cardiaques et cérébrales en étudiant l'ASO IONIS-486178 conjugué à un acide palmitique via un linker HA (C16-HA): le IONIS-877864. Nos résultats montrent que C16-HA améliore considérablement l'absorption des ASOs dans les muscles striés des souris DMSXL après administration systémique. L'injection sous-cutanée de IONIS-877864 entraîne une destruction de 92 % des ARNm de hDMPK mutés dans les muscles squelettiques et de 78 % dans le cœur. Toutefois, aucun effet n'a été observé dans le cerveau. La diminution des transcrits mutés de hDMPK dans les muscles squelettiques causée par IONIS-877864 a été associée à une amélioration significative de la force musculaire, confirmant ainsi la pertinence des ASOs conjugués à l'acide palmitique C16-HA pour le traitement aussi bien des tissus musculaires que cardiaques. Dans la troisième partie du travail, nous testons l'administration intrathécale des ASOs comme traitement des déficits cérébraux observés chez les patients DM1, étant donné qu'aucune chimie à ce jour n'a été capable de franchir la barrière hémato-encéphalique. IONIS-486178 a été évalué à la fois in vitro dans les cellules neurales DM1 et in vivo chez les souris DMSXL. L'ASO a détruit 80 % des foci nucléaires dans les cellules neurales. Cette destruction a permis la redistribution de MBNL1 et 2 et la correction de certaines anomalies d'épissage. L'injection intracérébroventriculaire de IONIS-486178 chez des souris DMSXL adultes a permis une diminution de jusqu'à 70 % des ARNm de hDMPK mutés dans les différentes régions du cerveau, un effet maintenu pendant douze semaines, et une biodistribution de l'ASO dans toutes les régions cérébrales. Enfin, l'analyse de l'activité globale des souris DMSXL par le test Open field montre qu'une seule injection intracérébroventriculaire des souris DMSXL néonatales par IONIS-486178 améliore significativement les anomalies comportementales 3 semaines après le traitement. Dans l'ensemble, cette thèse soutient la faisabilité d'un traitement par injections systémiques d'ASO pour les manifestations musculaires et cardiaques, et par administration intrathécale pour le traitement des déficits cérébraux chez les patients DM1. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most common muscular dystrophy in adults with a prevalence of 1/8,000. It is a multisystem disease that affects not only the muscle, but also many organs and systems such as the heart, brain, lungs, eyes, endocrine and digestive systems. A particularity of this disease is the existence of the severe congenital form responsible for 20 % of deaths. DM1 is caused by an expansion of a CTG triplet in the 3' non-coding region of the DMPK gene and the mutated RNAs accumulate in the nuclei forming nuclear foci. These foci sequester a splicing factor of the muscle blind protein family (MBNL) and disrupt CUGBP-Elav-like (CELF) function, leading to deregulation of alternative splicing and clinical symptoms. DM1 is a disease that affects quality of life, leads to disability, and reduces life expectancy of affected individuals and currently there is no curative treatment. Our hypothesis states that the destruction of mutated DMPK mRNAs using antisense oligonucleotides (ASOs) will prevent MBNL binding, and thus improve the DM1 phenotype in in vitro and in vivo models. The first part of my thesis consists in developing a cellular model of DM1. We first developed a standardized procedure to derive human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from lymphoblastic cell lines (LCL) using the Sendeï method. We generated hiPSCs from a man affected by an adult form of DM1 with 200 CTG repeats. The resulting hiPSCs retained the DM1 genetic mutation, had a normal karyotype, expressed pluripotency markers and were able to differentiate into three germ layers. Subsequently, we developed a human neuronal cell model of DM1 patients with 1300 CTG to verify the efficacy of ASOs. The neuronal cells recapitulate the main molecular phenotypes of DM1 by the presence of nuclear foci that co-localize with MBNL1 and MBNL2 proteins and the existence of alternative splicing defects. The second part is devoted to improving the potency of ASOs for the treatment of muscle, heart and brain events by studying the IONIS-486178 ASO conjugated to a palmitic acid (C16) via an HA linker (the IONIS-877864). Our results show that C16-HA significantly enhances ASO uptake in striated muscles of DMSXL mice after systemic administration. Subcutaneous injection of IONIS-877864 results in 92 % destruction of mutant hDMPK mRNAs in skeletal muscle and 78 % in heart. However, no effect was observed in the brain. The decrease in mutant hDMPK transcripts in skeletal muscles caused by IONIS-877864 was associated with a significant improvement in muscle strength, thus confirming the suitability of C16-HA palmitic acid-conjugated ASOs for the treatment of both muscle and cardiac tissues. In the third part of the work, we test intrathecal administration of ASOs as a treatment for brain deficits observed in DM1 patients, as no chemistry to date has been able to cross the blood-brain barrier. IONIS-486178 was evaluated both in vitro in DM1 neuronal cells and in vivo in DMSXL mice. ASO destroyed 80 % of nuclear foci in neural cells. This destruction allowed the redistribution of MBNL1 and 2, and the correction of some splicing defects. Intracerebroventricular injection of the IONIS-486178 in DMSXL mice adult resulted in a decrease of up to 70 % in hDMPK mutated mRNA levels in different brain regions, an effect maintained for twelve weeks, and biodistribution of ASO in all brain regions. Finally, analysis of the global activity of DMSXL mice by the Open field test shows that a single intracerebroventricular injection of neonatal DMSXL mice with IONIS-486178 significantly improves behavioral abnormalities 3 weeks after treatment. Overall, this thesis supports the feasibility of treatment with systemic injections of ASO for muscle and cardiac manifestations, and intrathecal administration for the treatment of brain deficits in DM1 patients.

Le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) implique l’utilisation d’un système de livraison musculaire efficace. L’évaluation d’oligonucléotides antisens (ASO) en conformation gapmer nous a permis d’identifier deux ASO, un de chimie 2’-O-méthoxyéthyle et l’autre avec des acides nucléiques bicycliques avec éthyle contraint, dont l’efficacité dans les modèles cellulaires et de souris de la DM1 était suffisante pour réduire significativement l’ARNm étendu de la DMPK. Il fut possible d’observer une réduction des foci nucléaires menant à une redistribution d’un régulateur d’épissage séquestré au noyau, ainsi corrigeant des erreurs d’épissage caractéristiques de la DM1. Plus particulièrement chez la souris DMSXL, l’injection systémique bihebdomadaire a mené à une maturation des fibres musculaires ainsi qu’au rétablissement de la force musculaire des sujets. Ce projet est la preuve de principe in vitro et in vivo qu’une thérapie génique par les ASO est concevable pour le traitement de la DM1. / A gene therapy for myotonic dystrophy type 1 (DM1) implies an effective muscular delivery method. The evaluation of antisenses oligonucleotides (ASO) enabled us to identify two gapmer ASOs, one with a 2’-O-methoxyethyl chemisty and the other with a constrained ethyl bicyclic nucleic acid, whose efficacy in DM1 cell and mouse models was sufficient to significantly reduced expanded hDMPK mRNA levels. Furthermore, reduction in DMPK induced nuclear foci resulted in redistribution of a sequestered alternative splicing regulator, leading to correction of mis-splicing events characteristic of DM1. In DMSXL mouse, biweekly systemic injection of ASOs induced muscle fiber maturation and a gain in forelimb strength. This project is the in vitro and in vivo proof of the principle that an ASO gene therapy is conceivable for treatment of DM1.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants dont la principale fonction est de réprimer l’expression génique en s’hybridant par complémentarité de séquence à leurs cibles ARN. L’activité des miARN est également régulée par leurs cibles qui entrent en compétition pour leur liaison. Certains de ces ARN compétiteurs endogènes (ARNce) résistent à la répression induite par le miARN et vont alors les séquestrer. Ils sont appelés éponges à miARN. La dérégulation des réseaux d’ARNce et des éponges à miARN est impliquée dans des processus pathologiques tels que le cancer. Au cours de ma thèse, nous nous sommes intéressés à la séquestration des miARN dans le mélanome cutané. Le mélanome provient de la transformation maligne du mélanocyte, une cellule spécialisée dans la production de pigment. S’il n’est pas pris en charge à temps, des métastases apparaissent et se disséminent rapidement dans l’organisme (ganglions, foie, poumons, cerveau, etc.). Des solutions thérapeutiques existent mais une faible proportion de patients y répondent de manière efficace nécessitant de nouvelles stratégies de traitement. Nous avons mis en évidence que l’ARN messager (ARNm) de TYRP1, gène spécifiquement exprimé dans le mélanocyte et donc le mélanome, porte le rôle d’éponge à miARN dans le mélanome métastatique. Ce rôle est indépendant de la fonction protéique de TYRP1. Nous avons déterminé que l’ARNm de TYRP1 séquestre le suppresseur de tumeurs miR-16 via des sites de liaison (MRE-16) non-canoniques. Les MRE-16 non-canoniques permettent à l’ARNm de TYRP1 de ne pas être dégradé par le miR-16 et le rendent donc plus stable dans la cellule de mélanome. La majorité du pool de miR-16 est ainsi séquestrée et ne peut donc plus réprimer ses cibles intervenant dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale in vivo. Afin de remettre en activité le miR-16 au sein de la cellule de mélanome, nous avons utilisé la technologie du « target site blocker » (TSB), un oligonucléotide antisens modifié ayant une forte stabilité et affinité pour sa cible. Le TSB, spécifique du MRE-16 de l’ARNm de TYRP1, entre en compétition pour la liaison à l’ARNm de TYRP1 avec le miR-16 pour permettre sa libération et son action sur ses cibles effectrices. Nous avons montré in vitro et in vivo via un modèle murin de xénogreffe de tumeur dérivée de patient que la stratégie du TSB est efficace contre le mélanome métastatique. Ces travaux ont permis l’identification d’un nouveau mécanisme oncogénique basé sur la séquestration de miARN et proposent une nouvelle stratégie de thérapie ciblée contre le mélanome métastatique. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs. They fine tune gene-expression through specific complementary interaction with their RNA targets. The miRNA repressive function towards a given RNA is highly regulated and in part dependent on the abundance of its other targets competing for miRNA’s binding. Some of these competing endogenous RNAs (ceRNAs) can resist to miRNA-mediated RNA decay thereby sequestering miRNAs. They are named miRNA sponges. Deregulation of ceRNAs and miRNA sponges networks are implicated in many pathologic processes including cancer. My PhD work focused on miRNA sequestration in cutaneous melanoma. Melanomas arise from the malignant transformation of melanocytes; the skin-cell specialized in pigment production. Most melanoma undergoes metastatic evolution, with metastatic cells spreading rapidly in the entire organism (lymph node, liver, lungs, brain, etc.). Early and complete resection of primary in situ melanoma is thus determinant for patient outcome. Since 2010, potent therapeutic options have been developed. Unfortunately, patients ultimately develop resistance while some are non-responders. There is thus an urgent need to develop new therapeutic strategies to treat metastatic melanoma. We have identified that the Tyrosinase Related Protein 1 (TYRP1) mRNA function as a miRNA sponge. TYRP1 is specifically expressed in the melanocytic lineage. TYRP1 mRNA governs melanoma growth endorsing thereby a non-coding function. We demonstrated that TYRP1 mRNA sequesters the tumor suppressor miR-16 via non-canonical miRNA binding sites (MREs-16). Non-canonical miR-16 binding lacks mRNA decay function favoring TYRP1 mRNA stability and miRNA sequestration. Sequestered miR-16 can no more repress its canonical targets involved in cell proliferation and tumor growth. To reset miR-16’s activity and block melanoma growth, we used “Target Site Blocker” (TSB). TSBs are modified antisense oligonucleotides with enhanced stability and affinity to its target. We designed a TSB, named TSB-T3, overlapping specially TYRP1 non-canonical MRE-16. We first showed that TSB-T3 binds to TYRP1 mRNA and competes with miR-16. Freed miR-16 binds to its canonical targets inducing their decay. TSB-T3 blocks melanoma cell growth in vitro and in vivo, using patient-derived tumor xenograft. We thus showed for the first time that TSB’s strategy redirecting a tumor suppressor miRNA is a potent tool to monitor metastatic melanoma growth. Together my PhD work brings out a new oncogenic mechanism based on miRNA sequestration and proposes an original strategy of targeted therapy against metastatic melanoma.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans le cadre de ce travail, nous avons synthétisé, isolé et caractérisé de nouvelles molécules amphiphiles dérivées d’acides nucléiques. Les modifications de ces structures ont été réalisées par voie chimique au moyen d’une réaction de chimie clic, la réaction de Huisgen. Les amphiphiles développés peuvent être classés dans deux catégories différentes : - Les amphiphiles de faible masse moléculaire qui dérivent de nucléosides et de glycosylnucléosides. Les propriétés d’auto organisation de ces composés ont été étudiées par différentes techniques, notamment de microscopie électronique et de diffraction des rayons X. La capacité de ces amphiphiles à former des gels a été évaluée dans différents solvants (eau et solvants organiques). Les propriétés de complexation des acides nucléiques de ces molécules ont également été mises en évidence. Les premiers résultats de transfection montrent que les glycosylnucléosides amphiphiles permettent l’internalisation des oligonucléotides à visée thérapeutique dans des cellules humaines de carcinome hépatocellulaire (Huh 7) en présence de sérum. - Les amphiphiles de masse moléculaire élevée qui dérivent d’oligonucléotides. La formation d’agrégats a été mise en évidence par différentes techniques telles que la microscopie électronique et la diffusion de la lumière. Les propriétés de reconnaissance associées à la séquence oligonucléotide ont été étudiées par des expériences de thermodénaturation. L’auto vectorisation de ces composés a pu être observée par microscopie d’épi-fluorescence et confocale. Cette auto vectorisation a également pu être quantifiée par cytométrie en flux sur une gamme variée de types cellulaires humains tels que les cellules épithéliales (Hela T4), les cellules gastriques (NCI) ou encore les cellules de carcinome hépatocellulaire (Huh-7). Ces travaux présentent également pour la première fois l’évaluation in cellulo d’oligonucléotides amphiphiles ciblant le virus de l’hépatite C. / *

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biologie : Lyon 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 183-209.