Le traitement du mélanome métastatique est longtemps resté cantonné à quelques chimiothérapies cytotoxiques à efficacité limitée. Récemment, le développement des immunothérapies et des thérapies ciblées a constitué une avancée majeure dans la prise en charge du mélanome. La découverte de mutations oncogéniques sur les voies de signalisation de la cellule tumorale a permis de définir de nouvelles cibles pour le développement d’ inhibiteurs pharmacologiques. Parmi ces mutations, la mutation BRAF V600E est présente dans 50% des mélanomes. Une des molécules anti-BRAF développée est le vémurafenib. L’efficacité de cette molécule a permis l’allongement de la durée de survie des patients en situation métastatique de 6 à 8 mois. Malheureusement, malgré la réponse initiale, l’échappement est la règle. Les mécanismes moléculaires responsables de la résistance acquise aux inhibiteurs de BRAF sont multiples et conduisent à l’activation de nombreuses voies de signalisation pour suppléer l’inhibition de BRAF. Actuellement la prise en charge des patients résistants aux inhibiteurs de BRAF n’est pas codifiée et s’avère complexe étant donné la multiplicité des mécanismes d’échappement. Dans le cadre de cette nouvelle approche de médecine personnalisée, de nouveaux outils doivent être développés dans le but (i) de tester l’efficacité de nouvelles molécules et (i) de tenter de prédire l’efficacité/la résistance des différents traitements disponibles. L’un de ces outils sont les xénogreffes de tumeurs issues directement des patients (Patient Derived Tumor Xenograft ou PDTX) ou « avatars ». Mon travail a consisté à mettre en place ce type d’outil pour répondre aux questions suivantes : Les modèles animaux développés sont-ils un bon modèle préclinique translationnel ? Permettent-ils d’étudier les modes d’action des nouvelles thérapies ciblées et d’explorer leurs mécanismes de résistance ? Si tel est le cas, peuvent-ils prédire une réponse clinique ? Différents modèles murins de xénogreffes de mélanome ont été mis au point et exploités. Des cellules tumorales puis des fragments de tumeurs ont été greffées en sous-cutané chez la souris immunodéficiente SCID. Les tumeurs ont été caractérisées en histologie et en biologie moléculaire pour montrer leur stabilité dans le modèle. Après plusieurs passages dans différentes générations de souris, les tumeurs conservent leurs mutations particulières. Par ailleurs différents traitements ont été administrés et la réponse à différentes stratégies thérapeutiques a été évaluée. Ce modèle nous a permis de valider l’efficacité des thérapies ciblées antiBRAF (vémurafenib) mais aussi d’autres approches visant les particularités métaboliques du mélanome. Le modèle avatar a permis de tester in vivo une association thérapeutique innovante qui associe un accélérateur de la phosphorylation mitochondriale, le DCA, et une molécule pro-oxydante, l’elesclomol, confirmant l’effet synergique obtenu in vitro. Par ailleurs l’elesclomol a pu être testé in vivo sur une tumeur devenue résistante à l’inhibiteur de BRAF, le vemurafenib. En outre, le modèle avatar constitue un bon modèle préclinique permettant d’aider directement le clinicien dans ses choix thérapeutiques. En effet nous avons réalisé une PDTX tout au long de l’évolution métastatique d’une patiente. Cette PDTX a permis de tester l’efficacité du vemurafenib et de réintroduire ce traitement à la patiente qui a pu bénéficier d’une amélioration clinique notable. 7 autres PDTX de patients ont été développées permettant de renforcer le modèle et de suivre de manière personnalisée le traitement de ces patients.Grâce à ce travail, nous définissons la place que peuvent prendre les avatars dans la prise en charge actuelle du mélanome métastatique. Ces modèles donnent une réponse précoce quant à leur résistance et aux alternatives thérapeutiques de seconde ligne. / For a long time the standard treatment for metastatic melanoma has been confined to a few cytotoxic chemotherapies with limited efficacy. Recently, the development of immunotherapies and targeted therapies represents major headways in melanoma care management. The discovery of oncogenic mutations on the signaling pathways of the tumor cell allowed the definition of new targets for developing inhibitor drugs. Among these mutations, BRAF V600E is seen in 50% of all melanomas. Vemurafenib is one of the anti-BRAF molecules recently developed. It has shown its efficacy with metastatic patients showing a survival increased by 6 to 8 months. Unfortunately, in spite of the initial positive reaction, the development of a resistance mechanism is ineluctable. There are numerous molecular mechanisms responsible for the acquired resistance to BRAF inhibitors which activate numerous signaling pathways to make up for the BRAF inhibition. Today, there are no standards of care for patients who become resistant to BRAF inhibitors. In the framework of this new personalized care approach, new tools must be developed to (i) test the efficacy of new molecules and (ii) try to predict the efficacy/resistance of the various treatments available. One of these tools is the Patient Derived Tumor Xenograft or PDTX, i.e. xenografts from tumors directly harvested on patients.My work consisted in implementing this type of tool to try and bring an answer to the following questions: Are the developed animal models a good tool for preclinical cross-sectional studies? Can they help study the action modes of new targeted therapies and explore their resistance mechanisms? If this is the case, can they predict a clinical response? Various murine models of melanoma xenografts have been designed and used. Tumor cells and later on tumor fragments were grafted subcutaneously in immunosuppressed SCID mice. Tumors were characterized in histology and molecular biology to show the stability of the model. After several passages in various generations of mice, the tumors retain their specific mutations. Furthermore, various treatments have been administered and the answers to the various therapeutic strategies have been evaluated. This model allowed us to validate the efficacy of antiBRAF targeted therapies (vemurafenib) but also other approaches targeting the metabolic characteristics of melanoma. This avatar model enabled to test in vivo an innovating therapeutic combination, associating an accelerator of oxidative phosphorylation, DCA, to a pre-oxidative molecule, elesclomol, validating the synergic effect obtained in vitro. Furthermore, elesclomol was tested in vivo on a tumor which became resistant to BRAF, vemurafenib. Furthermore, PTDX is a good preclinical tool to guide clinicians in their therapeutic choices. In fact we were able to develop a PDTX during the entire metastatic progression of a patient. This PDTX enabled us to test the efficacy of vemurafenib and reintroduce the treatment to the patient, who showed noticeable clinical improvements. Seven other PDTX were developed in order to reinforce the model and follow, in a personalized manner, the treatment of these seven patients. Thanks to this work, we are able to define the role of avatars in the care management of metastatic melanoma. These models give an early answer regarding tumor resistance and alternative second-line therapies.

Les cellules Natural Killer (NK) sont de grands lymphocytes granuleux capables de rapidement éliminer des cellules tumorales et des cellules infectées par des virus sans immunisation au préalable. Au cours de ma thèse, j’ai analysé plusieurs paramètres impliqués dans la reconnaissance et la lyse des cellules de mélanome par les NK. J’ai montré à partir d’analyses ex vivo que les NK sanguines de patients atteints de mélanome métastatique (stade III-IV) présentent un faible potentiel lytique. Cependant, de telles NK provenant de patients mélanomes de tout stade clinique activées in vitro par de l’IL-2 lysent efficacement des lignées de mélanome métastatique. L’analyse du phénotype de NK circulantes de patients stade IV a montré une diminution de l’expression du récepteur activateur NKp46/NCR1 comparé aux NK de donneurs sains. J’ai également montré une corrélation positive entre l’expression du NKp46 à la surface des NK et la durée du stade IV. Pour caractériser les NK infiltrant le mélanome, J’ai analysé ex vivo les NK infiltrant des ganglions métastatiques (GG) provenant de 25 patients en stade III. Les GG de patients mélanomes contiennent une population unique de NK CD56brightCD16+ représentant 50% des NK dans ces GG qui expriment fortement les récepteurs NK NCR, NKG2D, KIRs et produisent une plus forte proportion de perforin comparée aux NK CD56brightCD16- ganglionnaires. Les NK immunsélectionnées à partir de GG et activées avec de l’IL-2 ou de l’IL-15 lysent rapidement et efficacement des lignées cellulaires de mélanome. Elles sont caractérisées par des capacités lytiques supérieures aux NK sanguines. De plus, afin d’évaluer l’impact des NK au cours du mélanome, j’ai analysé in situ les NK infiltrant des ganglions sentinelles positive et négatif ainsi que des tumeurs cutanées primaires. Les NK sont faibles dans les GS ; cependant nous avons montré que le nombre de NK infiltrant ces ganglions sentinelles est associé à une plus forte rechute à cinq ans des patients. Les cellules NK infiltrant les tumeurs cutanées sont présentes préférentiellement dans la zone peritumorale et sont très rares dans la tumeur.Chez les patients atteints de mélanome, les NK sanguines et infiltrant les tumeurs ont des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles différentes. Une meilleure compréhension de telles différences doit être prise en compte, ainsi la biologie des NK et de leur modulation au cours du cancer est nécessaire pour développer une stratégie thérapeutique à base de cellules NK efficace. / Cytotoxic immune effectors can control the development and growth of certain solid tumours. Among these cytotoxic effectors, NK cells are capable of rapidly eliminating tumour cells and virus-infected cells without prior immunization.The objectives of my thesis were to evaluate the potential role of NK cells in the immune response against melanoma. First, I have characterized the functional status of blood NK cells from melanoma patients at different stages of the disease. I showed that ex vivo NK cells from most advanced stage III-IV patients display low lytic potential. However, IL-2-activated NK cells from patients efficiently lyse melanoma cells and that independently to the clinical stage. Moreover, the expression of the activating receptor NKp46/NCR1 by blood NK cells was decreased in stage IV patients compared to healthy donors, and a positive correlation between NKp46 expression by NK cells and the duration of stage IV was found. I have also characterized ex vivo NK cells infiltrating metastatic lymph nodes (M-LN) from stage III melanoma patients. I have identified in M-LN a unique subpopulation of mature CD56brightCD16+ NK cells that expressed higher NCR, NKG2D, KIRs, and perforin levels than CD56brightCD16- NK cells counterpart. NK cells from M-LN activated with IL-2 or IL-15, rapidly lysed metastatic melanoma cell lines with higher efficiency than autologous blood NK cells. Finally, to determine if NK cells display a prognostic value, I analysed by immunohistochemistry NK cells and other immune cells infiltrating positive and negative sentinel lymph nodes (SLN). SLN are characterized by high densities of macrophages and endothelial cells, even higher in SLN+. Few NK cells and Granzyme B+ cells infiltrate SLNs while CD8+ T cells are numerous. Moreover, numbers of NK cells in SLN correlated with higher rate of 5 year-relapse of patients. Compared to SLN, primary cutaneous melanomas contain high numbers of NK cells that are preferentially localized in the periphery of the tumour and are not related to the Breslow. My findings showed that in melanoma patients, circulating and tumour infiltrating NK cells display unique phenotypic and functional characteristics, indicating that tumour may alter their function. However, they respond to cytokine activation and acquire antitumor lytic potential. In the new landscape of melanoma treatment, NK cells are worthy to be considered for combined treatment with BRAF inhibitors.

Le mélanome cutané est la forme la plus mortelle des cancers cutanés, due à une dissémination métastatique importante. La prise en charge thérapeutique du stade métastatique a été révolutionnée il y a cinq ans avec les autorisations de mise sur le marché des thérapies ciblées (inhibiteurs des kinases BRAF V600- et de MEK) et des immunothérapies (anticorps monoclonaux anti-CTLA-4, anti-PD1, anti-PD-L1). Malgré la prolongation de la survie des patients, le développement de résistances aux inhibiteurs de BRAF, la toxicité et le faible taux de réponse aux immunothérapies sont problématiques. Pour ces raisons, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques reste une priorité. Notre équipe a récemment identifié une fonction non-codante d'un ARN messager (ARNm). Cet ARNm présente un mécanisme original d'éponge à microARN (miARN) impliqué dans le développement du mélanome. L'ARNm est stabilisé par la fixation d'un miARN sur des éléments de reconnaissance (MRE) non-canoniques, situés au sein de la séquence de l'ARNm. Une fois séquestré sur ces MRE non-canoniques, ce miARN ne peut plus exercer son activité suppresseur de tumeur. En particulier, il ne peut plus réguler post-transcriptionnellement l'expression d'une protéine impliquée dans la prolifération cellulaire. Nous avons démontré, dans le contexte du mélanome métastatique, que cet ARNm éponge est une cible thérapeutique pertinente. L'approche thérapeutique repose sur l'utilisation d'oligonucléotides antisens (ASO) qui masquent les sites de séquestration du miARN, c'est-à-dire les MRE non-canoniques, dans le but de libérer le miARN de l'éponge et de restaurer ses fonctions de régulation. Nous avons fait la preuve de concept du mode d'action de ces ASO et de leurs effets biologiques. Nous avons démontré que ces ASO diminuent la densité cellulaire in vitro et ralentissent la croissance tumorale dans un modèle murin de xénogreffe de cellules de mélanome ainsi que dans un modèle murin de xénogreffes de tumeurs dérivées de patients (PDX). Cette approche thérapeutique est innovante d'une part dans l'usage qui est fait des ASO, et d'autre part dans le concept de libération de miARN d'une éponge, qui permet de restaurer une régulation cellulaire post-transcriptionnelle anti-proliférative. Cette approche est spécifique de la présence de l'éponge et n'a pas d'équivalence en oncologie ni dans aucune autre pathologie. / Cutaneous melanoma is the most deadly form of skin cancer, due to major metastatic spread. Therapeutic care of metastatic stage has been revolutionized five years ago with the approvals of targeted therapies (BRAF V600- and MEK kinases inhibitors) and immunotherapies (monoclonal antibodies directed against CTLA-4, PD1 and PD-L1). Patients overall survival is now prolonged, but resistances to kinases inhibitors, low response rate to immunotherapies, and systemic toxicities are problematic. For these reasons, it remains necessary to identify new therapeutic targets. Our team has recently identified a non-coding function of a messenger RNA (mRNA). This mRNA acts as a microRNA (miRNA) sponge and is implicated into melanoma burden. This mRNA is stabilized by the binding of a miRNA onto non-canonical recognition elements (MREs), located within mRNA sequence. When sequestered on these non-canonical MREs, this miRNA cannot exert its tumor suppressor function. In particular, it cannot anymore post-transcriptionally regulate the expression of a protein implicated into cell proliferation. We demonstrated, in the context of metastatic melanoma, that this sponge mRNA is a relevant therapeutic target. The therapeutic approach uses oligonucleotides antisens (ASO) to mask sequestration sites, which are non-canonical MREs, in the objective to free miRNAs from the sponge and to restore its functions. We made the proof of concept of the molecular mechanism and the biological effects of ASOs. We demonstrated that these ASOs decrease cell density in vitro and slow down tumor growth in a melanoma xenograft mouse model and in a patient-derived xenograft melanoma mouse model. This is a very innovative therapeutic approach by the way we use ASO, and on the concept of liberating miRNA from sponge sequestration, in order to reset a post-transcriptional anti-proliferative cellular regulation. This approach is specific for the sponge and has no equivalence in oncology.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants dont la principale fonction est de réprimer l’expression génique en s’hybridant par complémentarité de séquence à leurs cibles ARN. L’activité des miARN est également régulée par leurs cibles qui entrent en compétition pour leur liaison. Certains de ces ARN compétiteurs endogènes (ARNce) résistent à la répression induite par le miARN et vont alors les séquestrer. Ils sont appelés éponges à miARN. La dérégulation des réseaux d’ARNce et des éponges à miARN est impliquée dans des processus pathologiques tels que le cancer. Au cours de ma thèse, nous nous sommes intéressés à la séquestration des miARN dans le mélanome cutané. Le mélanome provient de la transformation maligne du mélanocyte, une cellule spécialisée dans la production de pigment. S’il n’est pas pris en charge à temps, des métastases apparaissent et se disséminent rapidement dans l’organisme (ganglions, foie, poumons, cerveau, etc.). Des solutions thérapeutiques existent mais une faible proportion de patients y répondent de manière efficace nécessitant de nouvelles stratégies de traitement. Nous avons mis en évidence que l’ARN messager (ARNm) de TYRP1, gène spécifiquement exprimé dans le mélanocyte et donc le mélanome, porte le rôle d’éponge à miARN dans le mélanome métastatique. Ce rôle est indépendant de la fonction protéique de TYRP1. Nous avons déterminé que l’ARNm de TYRP1 séquestre le suppresseur de tumeurs miR-16 via des sites de liaison (MRE-16) non-canoniques. Les MRE-16 non-canoniques permettent à l’ARNm de TYRP1 de ne pas être dégradé par le miR-16 et le rendent donc plus stable dans la cellule de mélanome. La majorité du pool de miR-16 est ainsi séquestrée et ne peut donc plus réprimer ses cibles intervenant dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale in vivo. Afin de remettre en activité le miR-16 au sein de la cellule de mélanome, nous avons utilisé la technologie du « target site blocker » (TSB), un oligonucléotide antisens modifié ayant une forte stabilité et affinité pour sa cible. Le TSB, spécifique du MRE-16 de l’ARNm de TYRP1, entre en compétition pour la liaison à l’ARNm de TYRP1 avec le miR-16 pour permettre sa libération et son action sur ses cibles effectrices. Nous avons montré in vitro et in vivo via un modèle murin de xénogreffe de tumeur dérivée de patient que la stratégie du TSB est efficace contre le mélanome métastatique. Ces travaux ont permis l’identification d’un nouveau mécanisme oncogénique basé sur la séquestration de miARN et proposent une nouvelle stratégie de thérapie ciblée contre le mélanome métastatique. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs. They fine tune gene-expression through specific complementary interaction with their RNA targets. The miRNA repressive function towards a given RNA is highly regulated and in part dependent on the abundance of its other targets competing for miRNA’s binding. Some of these competing endogenous RNAs (ceRNAs) can resist to miRNA-mediated RNA decay thereby sequestering miRNAs. They are named miRNA sponges. Deregulation of ceRNAs and miRNA sponges networks are implicated in many pathologic processes including cancer. My PhD work focused on miRNA sequestration in cutaneous melanoma. Melanomas arise from the malignant transformation of melanocytes; the skin-cell specialized in pigment production. Most melanoma undergoes metastatic evolution, with metastatic cells spreading rapidly in the entire organism (lymph node, liver, lungs, brain, etc.). Early and complete resection of primary in situ melanoma is thus determinant for patient outcome. Since 2010, potent therapeutic options have been developed. Unfortunately, patients ultimately develop resistance while some are non-responders. There is thus an urgent need to develop new therapeutic strategies to treat metastatic melanoma. We have identified that the Tyrosinase Related Protein 1 (TYRP1) mRNA function as a miRNA sponge. TYRP1 is specifically expressed in the melanocytic lineage. TYRP1 mRNA governs melanoma growth endorsing thereby a non-coding function. We demonstrated that TYRP1 mRNA sequesters the tumor suppressor miR-16 via non-canonical miRNA binding sites (MREs-16). Non-canonical miR-16 binding lacks mRNA decay function favoring TYRP1 mRNA stability and miRNA sequestration. Sequestered miR-16 can no more repress its canonical targets involved in cell proliferation and tumor growth. To reset miR-16’s activity and block melanoma growth, we used “Target Site Blocker” (TSB). TSBs are modified antisense oligonucleotides with enhanced stability and affinity to its target. We designed a TSB, named TSB-T3, overlapping specially TYRP1 non-canonical MRE-16. We first showed that TSB-T3 binds to TYRP1 mRNA and competes with miR-16. Freed miR-16 binds to its canonical targets inducing their decay. TSB-T3 blocks melanoma cell growth in vitro and in vivo, using patient-derived tumor xenograft. We thus showed for the first time that TSB’s strategy redirecting a tumor suppressor miRNA is a potent tool to monitor metastatic melanoma growth. Together my PhD work brings out a new oncogenic mechanism based on miRNA sequestration and proposes an original strategy of targeted therapy against metastatic melanoma.

Depuis 2011, l'arrivée séquentielle de 8 molécules a grandement amélioré la prise en charge des patients atteint de mélanome métastatique (MM). Les 8 stratégies thérapeutiques ont montré leur efficacité au travers d’essais clinique de phase III, mais, la démonstration du gain de survie des traitements du MM comporte quelques limites inhérentes au contexte des essais cliniques. Les patients inclus au sein des essais sont sélectionnés et ne sont pas représentatifs des patients de la vie réelle. Compte-tenu de l’arsenal thérapeutique dont disposent les médecins, les patients sont désormais traités par plusieurs lignes de traitement, ce qui n’était pas le cas au moment de ces essais. Par ailleurs, compte-tenu du bénéfice clinique important apporté par ces médicaments, ils ont obtenu des prix élevés, jusqu’à 1 000 fois supérieurs aux anciennes chimiothérapies, posant la question de l’impact budgétaire et de l’efficience de ces traitements. Enfin, l’impact et l’évolution de ces nouvelles séquences de traitement sur la qualité de vie des patients, reste peu décrite.Ainsi, l’objectif principal de cette thèse est de réaliser une évaluation médico-économique (EME) de la prise en charge du MM, incluant les différentes séquences de traitement, en vie réelle, en France, depuis la commercialisation des innovations thérapeutiques, à partir des données issues de la cohorte de patients atteints de MM, MelBase.La première partie de ce travail a estimé le coût de prise en charge du MM depuis l’arrivée des innovations incluant les différentes lignes de traitement, en pratique courante. En 2017, le coût de la prise en charge du MM a été estimé à 269 682€ [IC95% : 244 196 ; 304 916] par patient, soit un coût multiplié par environ 165 depuis 2004, essentiellement lié à l'augmentation des coûts de traitements ainsi qu’à une survie prolongée.La deuxième partie de la thèse a évalué la qualité de vie (QdV) des patients atteints de MM en pratique clinique courante depuis l'arrivée des innovations thérapeutiques, et plus spécifiquement l’impact du changement de ligne sur l’évolution de la QdV. Cette étude a montré que la QdV semble être relativement stable au cours du temps avec cependant, une diminution statistiquement significative du score de QdV au moment du changement de ligne, bien que la baisse observée soit non cliniquement significative.A partir de ces résultats, l’efficience des différentes séquences de traitements dans le MM, en vie réelle, a été évaluée au sein de deux populations (BRAF et Sauvage). Au sein de la population BRAF, seules 2 stratégies sont présentes sur la frontière d’efficience. A un seuil de 150 000€ la stratégie Monothérapie ciblée-Anti-PD1 a environ 100% de chance d’être efficiente. A partir d’un seuil à 300 000€ la stratégie Anti-PD1-Bithérapie ciblée a 60% de chance d’être efficiente. Le Ratio Différentiel Coût-Résultat de la stratégie Anti-PD1-Bithérapie ciblée par rapport à la stratégie Monothérapie ciblée-Anti-PD1 est estimé à 180 441€/QALY.Au sein de la population SAUVAGE, les 4 stratégies sont sur la frontière d’efficience. Pour des seuils compris entre 0 et 800 000€ seule la stratégie ChimiothérapieImmunothérapie a plus de 50% de chance d’être efficiente.Au-delà de ces résultats cliniques et économiques, ce travail démontre la faisabilité et souligne la difficulté de travailler sur des données observationnelles. En effet, avec l'arrivée précoce des traitements en oncologie, concomitante avec l’allongement des durées de traitement, les multiple lignes de traitement et l’augmentation de la durée de vie des patients, montre l’importance d'évaluations en vie réelle des séquences de traitement, sur des données plus matures que dans les essais cliniques. Cependant, ces analyses nécessitent l’utilisation d’outils méthodologiques adaptés, pour tenir compte de la variabilité des caractéristiques des patients, la prise en compte des données manquantes ou encore l’extrapolation des données. / Since 2011, the commercialization of 8 new drugs has greatly improved the management of patients with metastatic melanoma (MM). Before 2011, it was mainly based on cytotoxic chemotherapy where patient’s survival estimated at 1 year did not exceed 20%. Since 2011, the approval of 8 molecules has significantly enhanced patient management and today 1 year estimated patient’s survival is up to 80%. The 8 therapeutic strategies have shown their efficacy through phase III clinical trials, but these different analyses have some limitations inherent to the context of clinical trials. First, the patients included in the trials are selected and are not representative of real-life patients. In addition, physicians have a significant number of therapeutic options available and patients are now treated by several treatment lines. Given the significant clinical benefit of these drugs, they have obtained high prices, up to 1,000 times higher than older treatments, raising the question of their efficiency.Therefore, the main objective of this thesis is to perform a cost-effectiveness analysis of MM management, including the different treatment sequences, in real life, in France, in 2019. However, the analysis of observational data raises methodological challenges related to the use of data collected in real-life. Also the secondary objective of this work is a methodological reflexion on, how to adapt existing methodologies used in cost-effectiveness analysis in order to propose a methodology appropriate for medico-economic studies performed in a cohort.This work was based on a cohort of MM patients, the MelBase cohort.The first part of this work estimated the cost of MM management since the arrival of innovations including the different treatment lines, in real-life clinical practice. A multi-state model was used to extrapolate costs considering dynamically the individual risks and events occurring during the observation period. In 2017, the cost of MM treatment was estimated at €269,682 [95%CI: 244,196; 304,916] per patient, a cost roughly multiplied by 165 since 2004, mainly due to increased treatment costs and prolonged survival.The second part of the thesis described the quality of life (QoL) of MM patients, and more specifically the impact of therapy change was assessed on QoL evolution. This study showed that QoL is fairly stable over time, except at time of treatment change where a statistically significant QoL, albeit a limited decrease is observed.The first 2 parts of this work allowed estimating the cost and QoL of patients with MM. Based on these results, the efficiency of immunotherapies and targeted therapies in MM, in France, was evaluated.In the BRAF population, only 2 strategies are present on the efficiency frontier. The increment cost-effectiveness ratio of the Anti-PD1-Bi-targeted therapy compared to the Mono-targeted therapy-Anti-PD1 is estimated at 180 441€/QALY. Among the WILD population, the 4 strategies are on the frontier of efficiency. For thresholds between 0 and 800 000€ only the Chemotherapy-Immunotherapy strategy has more than 50% chance of being efficient.In addition to clinical and economic results, this work highlights the importance of using observational data. With continues arrival of oncology treatments and the increase of patient follow-up (linked to a prolonged duration of treatment as well as management by multiple treatment lines), there is a need for more mature overall survival data. However, the methodological tools of cost-effectiveness analysis conducted in parallel with clinical trials seem no longer suitable for observational data, which need to be adapted.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs cytotoxiques impliqués dans la réponse immune contre les infections et les tumeurs. Pendant ma thèse j’ai étudié la fonctionnalité des cellules NK humaines en réponse à des lignées cellulaires de carcinome rénal à cellules claires (RCC) et de mélanome métastatique, deux tumeurs immunogènes. Nos résultats montrent que certaines mutations de VHL augmentent la susceptibilité des lignées RCC à la lyse NK. La perte de fonction de VHL corrèle avec une expression membranaire diminuée des molécules HLA-I par les lignées RCC mutées pour VHL. Chez les patients atteints de mélanome métastatique de stade IV, nous avons décrit un phénotype particulier des NK sanguines (NKp46dim/NKG2Adim) qui leur confère une forte activité antitumorale. Après traitement des patients par chimiothérapie, la fonctionnalité NK était réduite et le phénotype modifié. Pour étudier les cellules NK infiltrant les mélanomes, nous avons mis au point des conditions expérimentales pour caractériser les cellules NK de ganglions métastatiques de patients de stade III. Nos résultats préliminaires montrent que, par rapport aux ganglions sains, les NK des ganglions métastatiques présentent un phénotype altéré et un potentiel fonctionnel diminué. Nos résultats suggèrent que d’une part l’immunogénicité dépendante des oncogènes et d’autre part les altérations NK induites par la tumeur et/ou par la chimiothérapie sont des facteurs importants à considérer dans le choix des protocoles d’immunothérapie basés sur les cellules NK. / Natural Killer cells are cytotoxic lymphocytes involved in the immune response against tumours and infections. We investigated the NK-mediated functions in response to clear-cell renal cell carcinoma (RCC) and metastatic melanoma, two human immunogenic tumours. We showed that certain VHL mutations increased RCC cell susceptibility to NK lysis. VHL loss of function correlated with lower expression levels of membrane HLA-I molecules on VHL-mutated RCC and a decreased triggering of inhibitory NK receptors compared to RCC with a functional VHL. In stage IV melanoma patients, we showed that blood NK cells displayed a unique NKp46dim/NKG2Adim phenotype and high lytic potential towards melanoma cells. Following chemotherapy, NK cell function was reduced and the phenotype modulated. To study melanoma-infiltrating NK cells, we have set up experimental conditions to characterise NK cells in metastatic LNs from stage III melanoma patients. Our preliminary data show that, compared to normal LNs, NK cells from metastatic LNs are altered. Our findings suggest that oncogenic-dependent immunogenicity, tumour-associated NK alterations and chemotherapy are important factors that must be taken into account in the choice of immunotherapeutic protocols based on NK cells.

Le traitement du mélanome métastatique est longtemps resté cantonné à quelques chimiothérapies cytotoxiques à efficacité limitée. Récemment, le développement des immunothérapies et des thérapies ciblées a constitué une avancée majeure dans la prise en charge du mélanome. La découverte de mutations oncogéniques sur les voies de signalisation de la cellule tumorale a permis de définir de nouvelles cibles pour le développement d' inhibiteurs pharmacologiques. Parmi ces mutations, la mutation BRAF V600E est présente dans 50% des mélanomes. Une des molécules anti-BRAF développée est le vémurafenib. L'efficacité de cette molécule a permis l'allongement de la durée de survie des patients en situation métastatique de 6 à 8 mois. Malheureusement, malgré la réponse initiale, l'échappement est la règle. Les mécanismes moléculaires responsables de la résistance acquise aux inhibiteurs de BRAF sont multiples et conduisent à l'activation de nombreuses voies de signalisation pour suppléer l'inhibition de BRAF. Actuellement la prise en charge des patients résistants aux inhibiteurs de BRAF n'est pas codifiée et s'avère complexe étant donné la multiplicité des mécanismes d'échappement. Dans le cadre de cette nouvelle approche de médecine personnalisée, de nouveaux outils doivent être développés dans le but (i) de tester l'efficacité de nouvelles molécules et (i) de tenter de prédire l'efficacité/la résistance des différents traitements disponibles. L'un de ces outils sont les xénogreffes de tumeurs issues directement des patients (Patient Derived Tumor Xenograft ou PDTX) ou " avatars ". Mon travail a consisté à mettre en place ce type d'outil pour répondre aux questions suivantes : Les modèles animaux développés sont-ils un bon modèle préclinique translationnel ? Permettent-ils d'étudier les modes d'action des nouvelles thérapies ciblées et d'explorer leurs mécanismes de résistance ? Si tel est le cas, peuvent-ils prédire une réponse clinique ? Différents modèles murins de xénogreffes de mélanome ont été mis au point et exploités. Des cellules tumorales puis des fragments de tumeurs ont été greffées en sous-cutané chez la souris immunodéficiente SCID. Les tumeurs ont été caractérisées en histologie et en biologie moléculaire pour montrer leur stabilité dans le modèle. Après plusieurs passages dans différentes générations de souris, les tumeurs conservent leurs mutations particulières. Par ailleurs différents traitements ont été administrés et la réponse à différentes stratégies thérapeutiques a été évaluée. Ce modèle nous a permis de valider l'efficacité des thérapies ciblées antiBRAF (vémurafenib) mais aussi d'autres approches visant les particularités métaboliques du mélanome. Le modèle avatar a permis de tester in vivo une association thérapeutique innovante qui associe un accélérateur de la phosphorylation mitochondriale, le DCA, et une molécule pro-oxydante, l'elesclomol, confirmant l'effet synergique obtenu in vitro. Par ailleurs l'elesclomol a pu être testé in vivo sur une tumeur devenue résistante à l'inhibiteur de BRAF, le vemurafenib. En outre, le modèle avatar constitue un bon modèle préclinique permettant d'aider directement le clinicien dans ses choix thérapeutiques. En effet nous avons réalisé une PDTX tout au long de l'évolution métastatique d'une patiente. Cette PDTX a permis de tester l'efficacité du vemurafenib et de réintroduire ce traitement à la patiente qui a pu bénéficier d'une amélioration clinique notable. 7 autres PDTX de patients ont été développées permettant de renforcer le modèle et de suivre de manière personnalisée le traitement de ces patients.Grâce à ce travail, nous définissons la place que peuvent prendre les avatars dans la prise en charge actuelle du mélanome métastatique. Ces modèles donnent une réponse précoce quant à leur résistance et aux alternatives thérapeutiques de seconde ligne.

Le mélanome métastatique représente le plus mortel des cancers cutanés par sa forte résistance aux thérapies conventionnelles. Les cellules initiatrices de tumeurs (CIT) sont présentes dans de nombreux cancers dont le mélanome. Ces cellules, capables de s’autorenouveller, sont à l’origine de la récidive tumorale et des métastases représentant une cible pour le développement de nouveaux traitements. Les CIT sont confinées dans un microenvironnement tumoral dans lequel des facteurs sécrétés tels que l'Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1) et le Transforming growth factor (TGF-β) favorisent la transition épithéliomésenchymateuse (TEM), un processus clef lié à l’émergence des CIT. En utilisant des cellules de mélanome métastatique, nous avons montré qu’une inhibition d’IGF-1 induit une diminution de la tumorigénicité des cellules en diminuant la capacité des B16-F10 à former des métastases pulmonaires. Outre son action sur la prolifération cellulaire, IGF-1 est impliqué dans le processus de TEM favorisant les propriétés migratoires et invasives des cellules B16-F10. Par ailleurs, IGF-1 joue un rôle majeur dans le maintien des CIT expliquant la forte résistance des mélanomes aux thérapies conventionnelles. Des expériences préliminaires suggèrent que ces activités induites par IGF-1 pourraient être médiées en partie par le facteur TGF-β, un facteur clef de la TEM. D'autres résultats confortent cette hypothèse en montrant une implication directe du TGF-β dans le caractère souche des cellules B16-F10. Ces travaux montrent que l’inhibition de la voie IGF-1/IGF-1R dans le microenvironnement tumoral pourrait être une bonne stratégie pour le développement de traitements anti-tumoraux contre le mélanome. / Metastatic melanoma is arguably the most virulent among human cancers, owing to its propensity to metastasize, and its resistance to conventional therapies. Like in many other cancers, tumor stem cells or tumor initiating cells (TIC), have been identified in melanoma. These cells have the unique ability to self-sustain and renew the tumor and thus represent an interesting target for the development of new therapeutic strategies. TIC are nested in a confined microenvironment where secreted-factors such as Insulin-Like Growth Factor- 1 (IGF-1) and transforming growth factor (TGF-β) promote epithelialmesenchymal transition (EMT), a key process in stemness features acquisition. In this context, we investigated the effects IGF-1 on TIC behavior. Using B16-F10 metastatic melanoma cell line, we show that IGF-1 downregulation curbs lung metastasis suggesting that IGF-1 plays a direct role in the intrinsic tumorigenic potential of these cells.markers associated with an increased expression of the epithelial marker E-cadherin and of the major regulator of melanocyte differentiation MITF. Most importantly, IGF-1 inhibition sharply decreased stemness features, reducing the expression of key stem markers and functional characteristics of MIC. This was associated with an important sensitivity to mitoxantrone treatment. Interestingly, our preliminary data suggest the EMT key component, TGF-β, conveys IGF-1-mediated effects. Indeed, TGF-β directly affects B16-F10 stemness phenotype and markers. In summary, we show that the IGF-1/IGF-1R nexus represents an interesting target for the development of novel therapeutic strategies against metastatic melanoma.

Le mélanome métastatique reste un enjeu majeur de santé publique. Les avancées fulgurantes de ces dernières années ont permis d’améliorer la prise en charge thérapeutique, notamment avec l’arrivée des anticorps bloquant ou agonistiques ciblant les molécules de co-inhibition ou de co-stimulation. Cependant, certains patients sont réfractaires à tout traitement. Il est donc nécessaire de mettre en évidence l’importance de certains paramètres immunologiques permettant d’améliorer le suivi des patients de stade III à haut risque de récidive. De plus, il est primordial de découvrir des marqueurs prédictifs associés à la réponse à ces différents traitements immunomodulateurs. Nous avons identifié une association entre une fréquence élevée de CD45RA+CD4+ et de CD3-CD56- au sein des métastases ganglionnaires avec la survenue d’une récidive anticipée.Une forte expression de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD8+, une faible proportion de Tregs ou une faible expression de PD-L1 à la surface des T circulants sont associées à une meilleure survie. Aussi, la mise en place d’un test in-vitro étudiant les réactivités fonctionnelles des lymphocytes infiltrant les tumeurs a permis de dégager l’importance de l’expression de CD95/Fas sur les T CD4+ circulants et de CD137/4-1BB sur les T CD8+ circulants dans la prédiction de la réponse à l’ipilimumab (anti-CTLA-4) et à la combinaison ipilimumab + nivolumab (anti-PD-1). Par ailleurs, le pattern d’expression des récepteurs de chimiokines à la surface des lymphocytes T périphériques permet de détecter les localisations métastatiques de mélanome. Cette étude a révélé également l’importance biologique de l’axe CCR9/CCL25 dans l’immunosurveillance naturelle anti-tumorale. / Metastatic melanoma (MM) is an unmet medical need. The development of immune checkpoint blockers (ICB) improved patient’s clinical outcomes. However, some patients still do not respond to these therapies. To adress these issues, we must find some immunological parameters which predict the relapse of high risk resected stage III melanoma patients. Moreover, it is an urgent need to identify some predicting parameters to these ICB. In our studies, high frequencies of CD45RA+CD4+ and CD3-CD56- in metastatic lymph nodes are associated with a short relapse-free survival. Higher expression of NKG2D on CD8 T cells, low Tregs and low PD-L1 expression on circulating T cells are associated with a prolonged overall survival.Furthermore, we designed an in-vitro test to assess intratumor lymphocytes reactivities to ICB and cytokines (IL-2 and IFNα2a). Low expression of CD95/Fas on CD4+ circulating T cells and high expression of CD137/4-1BB on circulating CD8+ T cells are associated with the response to ipilimumab (anti-CTLA-4) and to the combination ipilimumab + nivolumab (anti-PD-1), respectively. In addition, the chemokine receptor pattern expressed at the surface of circulating lymphocytes could predict the metastatic spreading of melanoma. In this last study, we demonstrated the critical role of CCR9/CCL25 pathway in the natural anti-cancer immune surveillance.

La sensibilité des cellules de mélanomes aux molécules de thérapies ciblées dépend du microenvironnement tumoral (interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire). Les systèmes tridimensionnels (3D) de culture in vitro reflètent mieux l’architecture structurelle native des tissus et sont attrayants pour l’étude des interactions cellulaires. Nous avons développé et comparé plusieurs modèles de mélanome métastatique : les cellules de mélanomes (SK-MEL-28 et SK-MEL-3, mutées BRAF V600E et SK-MEL-2, BRAF sauvages) cultivées en monocouche (2D) et co-cultivées en 3D sur des équivalents de derme avec des fibroblastes, afin de mieux comprendre les facteurs modulant la sensibilité cellulaire à un inhibiteur de BRAF (BRAFi, Vémurafenib) et au Vémurafenib associé à un inhibiteur de MEK (MEKi, Cobimetinib). La sensibilité cellulaire aux traitements a été évaluée sous différents aspects : prolifération cellulaire (numération cellulaire, incorporation d'EdU, test MTS), analyse des voies de signalisation MAPK et PKB / Akt (Western-blot), apoptose (TUNEL), libération de cytokines et de facteurs de croissance (ELISA) et histologie (modèles 3D). Un effet cytostatique de BRAFi a été observé sur les cellules SK-MEL-28 et SK-MEL-3 cultivées dans les modèles 2D et 3D. La lignée cellulaire SK-MEL-2 était résistante au BRAFi lorsqu'elle a été cultivée en monocouche, mais sensible lorsqu'elle a été co-cultivée avec des fibroblastes incorporés dans une matrice de collagène de type I. Les milieux conditionnés par les fibroblastes 3D (équivalents de derme) ont sensibilisé les cellules SK-MEL-2 (2D) au BRAFi. L'analyse des surnageants de culture cellulaire a révélé que les équivalents de derme libéraient certains facteurs solubles (IL-6, IL-8, HGF, TGF-β) : ces sécrétions ont été modifiées au cours du traitement par Vémurafenib. La combinaison du traitement avec MEKi a renforcé l'action du Vémurafenib sur les cellules de mélanomes métastatiques tout en diminuant la capacité de prolifération des fibroblastes. Des populations de cellules contenant des cellules de mélanomes ou des fibroblastes associés au cancer (CAFs) ont été isolées à partir d'une biopsie de métastase cutanée provenant d'une patiente atteinte d'un mélanome métastatique. Ces cellules ont permis de réaliser des modèles de mélanome métastatique patient-spécifique afin d’étudier in vitro la sensibilité des cellules de la patiente aux traitements dans un microenvironnement tumoral (sécrétion paracrine de cellules stromales et matrice de collagène). Ces modèles prédictifs 3D patient-spécifique pourront être utilisés pour déterminer des stratégies de thérapies personnalisées, ainsi que pour comprendre les phénomènes de résistance des cellules de mélanomes aux traitements. / Melanoma cell sensitivity to targeted therapy molecules is dependent on the tumor microenvironment (cell-cell and cell-extracellular matrix interactions). Three dimensional (3D) in vitro cell culture systems better reflect the native structural architecture of tissues and are attractive to investigate cellular interactions. We have developed and compared several metastatic melanoma models: melanoma cells (SK-MEL-28 and SK-MEL-3, BRAF V600E mutant and SK-MEL-2 BRAF wt) cultured as a monolayer (2D) and co-cultured on 3D dermal equivalents with fibroblasts to better unravel factors modulating cell sensitivity to a BRAF inhibitor (BRAFi, Vemurafenib) and a BRAFi combined with a MEK inhibitor (MEKi, Cobimetinib). Cell sensitivity to treatments was evaluated under various aspects: cell proliferation (cell counting, EdU incorporation, MTS assay), MAPK and PKB/Akt signaling pathway analysis (Western-blotting), apoptosis (TUNEL), cytokine and growth factor release (ELISA) and histology (3D models). A cytostatic effect of BRAFi was observed on SK-MEL-28 and SK-MEL-3 cells in both models. SK-MEL-2 cell line was clearly resistant to BRAFi when cultured as a monolayer but not when co-cultured with 3D fibroblasts embedded in a type I collagen matrix. Conditioned media provided by 3D fibroblasts (dermal equivalents) underlined 2D SK-MEL-2 sensitivity to BRAFi. Cell culture supernatant analysis revealed that dermal equivalents released some soluble factors (IL-6, IL-8, HGF, TGF-β): these secretions were modified during vemurafenib treatment. The combination of treatment with MEKi enhances the action of Vemurafenib on metastatic melanoma cells while decreasing the proliferation capacity of fibroblasts. Cell populations containing melanoma cells or fibroblasts associated with cancer (CAFs) were isolated from a cutaneous metastasis biopsy of a patient with metastatic melanoma. These cells allowed the realization of patient-specific models of metastatic melanoma in order to study in vitro the sensitivity of the patient’s melanoma cells to treatments in a tumor microenvironment (paracrine secretion of stromal cells and collagen matrix). These 3D predictive patient-specific models could be used to determine personalized therapy strategies, as well as to understand the resistance phenomena of melanoma cells to treatments