Le mélanome métastatique reste un enjeu majeur de santé publique. Les avancées fulgurantes de ces dernières années ont permis d’améliorer la prise en charge thérapeutique, notamment avec l’arrivée des anticorps bloquant ou agonistiques ciblant les molécules de co-inhibition ou de co-stimulation. Cependant, certains patients sont réfractaires à tout traitement. Il est donc nécessaire de mettre en évidence l’importance de certains paramètres immunologiques permettant d’améliorer le suivi des patients de stade III à haut risque de récidive. De plus, il est primordial de découvrir des marqueurs prédictifs associés à la réponse à ces différents traitements immunomodulateurs. Nous avons identifié une association entre une fréquence élevée de CD45RA+CD4+ et de CD3-CD56- au sein des métastases ganglionnaires avec la survenue d’une récidive anticipée.Une forte expression de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD8+, une faible proportion de Tregs ou une faible expression de PD-L1 à la surface des T circulants sont associées à une meilleure survie. Aussi, la mise en place d’un test in-vitro étudiant les réactivités fonctionnelles des lymphocytes infiltrant les tumeurs a permis de dégager l’importance de l’expression de CD95/Fas sur les T CD4+ circulants et de CD137/4-1BB sur les T CD8+ circulants dans la prédiction de la réponse à l’ipilimumab (anti-CTLA-4) et à la combinaison ipilimumab + nivolumab (anti-PD-1). Par ailleurs, le pattern d’expression des récepteurs de chimiokines à la surface des lymphocytes T périphériques permet de détecter les localisations métastatiques de mélanome. Cette étude a révélé également l’importance biologique de l’axe CCR9/CCL25 dans l’immunosurveillance naturelle anti-tumorale. / Metastatic melanoma (MM) is an unmet medical need. The development of immune checkpoint blockers (ICB) improved patient’s clinical outcomes. However, some patients still do not respond to these therapies. To adress these issues, we must find some immunological parameters which predict the relapse of high risk resected stage III melanoma patients. Moreover, it is an urgent need to identify some predicting parameters to these ICB. In our studies, high frequencies of CD45RA+CD4+ and CD3-CD56- in metastatic lymph nodes are associated with a short relapse-free survival. Higher expression of NKG2D on CD8 T cells, low Tregs and low PD-L1 expression on circulating T cells are associated with a prolonged overall survival.Furthermore, we designed an in-vitro test to assess intratumor lymphocytes reactivities to ICB and cytokines (IL-2 and IFNα2a). Low expression of CD95/Fas on CD4+ circulating T cells and high expression of CD137/4-1BB on circulating CD8+ T cells are associated with the response to ipilimumab (anti-CTLA-4) and to the combination ipilimumab + nivolumab (anti-PD-1), respectively. In addition, the chemokine receptor pattern expressed at the surface of circulating lymphocytes could predict the metastatic spreading of melanoma. In this last study, we demonstrated the critical role of CCR9/CCL25 pathway in the natural anti-cancer immune surveillance.

Cancer immunotherapy has proven to be challenging as it depends on overcoming multiple mechanisms that mediate immune tolerance to self-antigens. In situ immunization is based on the concept that it is possible to break immune tolerance by inducing tumor cell death in situ in a manner that provides antigen presenting cells such as dendritic cells (DCs) with a wide selection of tumor antigens that can then be presented to the immune system and result in a therapeutic anticancer immune response. Based on recent advances in the understanding of antitumor immunity, we designed a three-step approach to in situ immunization to lymphoma: (1) Inducing immunogenic tumor cell death with the chemotherapeutic drug Doxorubicin (Dox). Dox enhances the expression of "eat-me" signals by dying tumor cells, facilitating their phagocytosis by dendritic cells (DCs). Due to the vesicant activity of Dox, microparticles (MPs) made of PLGA (a biodegradable polymer) can safely deliver Dox intratumorally and are effective vaccine adjuvants; (2) Enhancing antigen presentation and T cell activation using anti-OX40; (3) Sustaining T cell responses by checkpoint blockade using anti-CTLA-4. In vitro, Dox MPs were less cytotoxic to DCs than to B lymphoma cells, did not require internalization by the lymphoma cells, and significantly enhanced phagocytosis of tumor cells by DCs as compared to soluble Dox. In mice, this three-step therapy induced CD4- and CD8-dependent systemic immune responses that enhanced T cell infiltration into distant lymphoma tumors leading to their eradication and significantly improving survival. Our findings demonstrate that systemic antitumor immune responses can be generated locally by three-step therapy and merit further investigation of three-step therapy for immunotherapy of lymphoma patients. Furthermore, we designed another in situ immunization approach using PLGA MPs loaded with both Dox and CpG oligodeoxynucleotides (CpG). The addition of CpG was to further enhance the Dox MP design by including an agent that addresses Step Two in situ, by enhancing tumor antigen presentation by DCs. In vitro, we show that Dox/CpG MPs can kill B and T lymphoma cells and are less toxic to DCs than soluble Dox. In vivo, Dox/CpG MPs combined with anti-CTLA-4 and anti-OX40 generated systemic immune responses that suppressed injected and distant tumors in a murine B lymphoma model, leading to tumor-free mice. The combination regimen was also effective at reducing T cell lymphoma and melanoma tumor burdens. In conclusion, Dox/CpG MPs represent a versatile, efficient and safe tool for in situ immunization that could provide a promising component of immunotherapy for patients with a variety of types of cancer.

La réponse immune représente une réponse complexe à laquelle correspond une succession d’événements orchestrés finement. Parmi les mécanismes qui régulent la réponse immune, les lymphocytes T régulateurs (Tregs) assurent le maintien de la tolérance en périphérie et le contrôle des réponses immunes adaptatives. Ils représentent une population hétérogène et leurs mécanismes de suppression sont toujours l’objet d’intenses recherches. Suivant le contexte de suppression et leur nature, les lymphocytes Tregs réalisent une inhibition de l’activation des lymphocytes Th, soit directement, soit via la modulation de la fonction des cellules dendritiques (DC). Dans un modèle d’immunisation par des cellules dendritiques chargées de KLH, les lymphocytes Tregs naturels contrôlent sélectivement l’initiation des réponses de type Th1/CTL spécifiques de l’antigène. Le but de ce travail était de définir quels sont les acteurs potentiels du contrôle de cette réponse. A l’aide de l’anticorps PC61 dirigé contre le récepteur CD25 et éliminant les lymphocytes Tregs naturels, nous avons montré que le ligand de costimulation CD70 joue un rôle clé dans leur régulation de la réponse Th1/CTL (Article 1). Ainsi, dans des conditions normales, la cytokine IL-12 induit principalement l’initiation de la réponse Th1 in vivo, tandis qu’en l’absence de lymphocytes Tregs naturels, la voie CD70/CD27 est une voie alternative d’induction de l’IFN-γ. Cette voie d’activation pourrait être opérationnelle dans certains contextes infectieux lorsque les lymphocytes Tregs sont déstabilisés voire éliminés, par exemple lors d’infections par Toxoplasma gondii ou par les virus HTLV1, SIV ou HIV. Nous avons montré que les lymphocytes Tregs naturels diminuent l’expression du ligand CD70 sur les DC, de manière dépendante de son récepteur CD27. Ensuite, nous nous sommes intéressés à une deuxième population de lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes Tregs ICOShigh induits in vivo par le traitement avec l’anticorps anti-CTLA-4. Dans le cadre d’une colite induite par l’agent alkylant TNBS et mettant en jeu une réponse Th1, cette population de lymphocytes Tregs amplifiée par le traitement à l’anticorps anti-CTLA-4 régule la réponse immune via la cytokine anti-inflammatoire IL-10 et l’enzyme immunosuppressive IDO (Article 2). Ainsi, les résultats obtenus nous ont permis de répondre à notre objectif et de définir certains mécanismes de suppression des lymphocytes Tregs naturels et des lymphocytes Tregs induits. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons cherché à comparer les populations de lymphocytes Tregs naturels et ICOShigh présentes dans l’intestin d’une souris naïve. Une analyse transcriptomique a révélé que ces deux populations s’opposent sur les plans phénotypique et fonctionnel. Nous proposons un modèle dans lequel les deux populations de lymphocytes Tregs agiraient en synergie pour maintenir l’homéostasie intestinale. Les lymphocytes Tregs ICOShigh différenciés au niveau local et continuellement activés contrôleraient la réponse inflammatoire associée à la présence de la flore commensale. Les lymphocytes Tregs naturels, en quiescence dans les ganglions mésentériques, n’interviendraient qu’en cas d’infection par des pathogènes. L’étude des lymphocytes T régulateurs soulève un certain nombre de concepts clés de l’immunité : la spécificité des réponses, la distinction des microorganismes commensaux et pathogènes… Mieux connaître les lymphocytes Tregs dans un modèle murin permettra de mieux comprendre les réponses inflammatoires intestinales chroniques observées chez l'homme et d’envisager, à terme, de nouveaux traitements. / An immune response is complex and implies numerous sequential events. It is regulated by different mechanisms, among which regulatory T cells maintain peripheral tolerance and control adaptive immune responses. Regulatory T cells are very heterogeneous and suppress immune responses through different mechanisms, still under investigation. They can inhibit T cell activation directly or through the modulation of dendritic cell function, depending on their nature and the tissular context. In a dendritic cell-mediated immunization model, naturally occurring regulatory T cells selectively control the priming of antigen-specific Th1/CTL responses. Our goal was to define the potential actors of this control, targeted by natural regulatory T cells. Using the PC61 antibody which targets and depletes these cells, we showed that the costimulation ligand CD70 plays a key role in their control of Th1/CTL responses (first article). We showed that mainly IL-12 provokes Th1 development in normal conditions, wheras CD70 plays a major role in priming Th1 responses in the absence of natural Tregs. This pathway can be operational if regulatory T cells are destabilized or even depleted, for example during infection with Toxoplasma gondii or with HTLV1, SIV or HIV. We showed that natural Tregs downregulate CD70 expression on the surface of DCs. Next, we focused on another regulatory T cell population, induced in vivo by the anti-CTLA-4 mAb treatment. In a model of pro-Th1 colitis, induced by the alkylating agent TNBS, these ICOShigh regulatory T cells exert an IL-10 and IDO-dependant control over the immune response (second article). Thus, we succeeded in determining some control mechanisms of the immune response targeted by two populations of regulatory T cells. Finally, we compared two regulatory T cell populations: naturally occurring regulatory T cells and ICOShigh regulatory T cells from the intestines of naïve mice. A transcriptional analysis revealed two populations phenotypically and functionally distinct. We proposed a model in which these populations act synergistically and both maintain intestinal homeostasis. ICOShigh regulatory T cells might control commensal gut flora-specific inflammatory responses and quiescent natural regulatory T cells from mesenteric lymph nodes might control potential pathogen infections. As a conclusion, this study raises some immunological issues: specificity of immune responses, distinction between commensal and pathogenic microorganisms… A better knowledge of these regulatory populations will lead to a better understanding of human intestinal responses and in the medium term will lead to new therapeutic approaches and tools.

Biological activity of IL-2 and IL-7 in vivo is significantly increased when complexed with some of the respective anti-cytokine mAb. Different immune cell subsets can be preferentially stimulated depending on the anti-IL-2 mAb used to complex IL-2. IL-2/anti-IL-2 mAb S4B6 immunocomplexes (IL-2/S4B6) induce preferential expansion of CD122high cells whereas IL-2/anti-IL-2 mAb JES6-1 immunocomplexes (IL-2/JES6-1) highly selectively stimulate CD25high cells in mice. Similarly, IL-7/anti-IL-7 mAb M25 immunocomplexes (IL-7/M25) possess higher stimulatory activity for both naïve and memory CD8+ T cells in vivo in comparison to free IL-7. CTLA-4 and PD-1 molecules are inhibitory receptors which negatively regulate proliferation, survival and effector functions of T cells. Blocking antibodies against these molecules represent promising immunotherapeutic tool for treatment of malignant diseases. We examined possible synergism of IL-2/S4B6 and αCTLA-4 plus αPD-1 mAbs in tumor-bearing mice. We found that the expansion of recently activated CD8+ T cells driven by IL-2/S4B6 was further augmented by αCTLA-4 plus αPD-1 mAbs. However, these two immunotherapeutic approaches did not show synergistic antitumor activity in any mouse tumor model tested. Next, we showed that IL-7/M25 possessed higher biological activity...

La réponse immune représente une réponse complexe à laquelle correspond une succession d’événements orchestrés finement. Parmi les mécanismes qui régulent la réponse immune, les lymphocytes T régulateurs (Tregs) assurent le maintien de la tolérance en périphérie et le contrôle des réponses immunes adaptatives. Ils représentent une population hétérogène et leurs mécanismes de suppression sont toujours l’objet d’intenses recherches. Suivant le contexte de suppression et leur nature, les lymphocytes Tregs réalisent une inhibition de l’activation des lymphocytes Th, soit directement, soit via la modulation de la fonction des cellules dendritiques (DC). <p>Dans un modèle d’immunisation par des cellules dendritiques chargées de KLH, les lymphocytes Tregs naturels contrôlent sélectivement l’initiation des réponses de type Th1/CTL spécifiques de l’antigène. Le but de ce travail était de définir quels sont les acteurs potentiels du contrôle de cette réponse. A l’aide de l’anticorps PC61 dirigé contre le récepteur CD25 et éliminant les lymphocytes Tregs naturels, nous avons montré que le ligand de costimulation CD70 joue un rôle clé dans leur régulation de la réponse Th1/CTL (Article 1). Ainsi, dans des conditions normales, la cytokine IL-12 induit principalement l’initiation de la réponse Th1 in vivo, tandis qu’en l’absence de lymphocytes Tregs naturels, la voie CD70/CD27 est une voie alternative d’induction de l’IFN-γ. Cette voie d’activation pourrait être opérationnelle dans certains contextes infectieux lorsque les lymphocytes Tregs sont déstabilisés voire éliminés, par exemple lors d’infections par Toxoplasma gondii ou par les virus HTLV1, SIV ou HIV. Nous avons montré que les lymphocytes Tregs naturels diminuent l’expression du ligand CD70 sur les DC, de manière dépendante de son récepteur CD27. <p>Ensuite, nous nous sommes intéressés à une deuxième population de lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes Tregs ICOShigh induits in vivo par le traitement avec l’anticorps anti-CTLA-4. Dans le cadre d’une colite induite par l’agent alkylant TNBS et mettant en jeu une réponse Th1, cette population de lymphocytes Tregs amplifiée par le traitement à l’anticorps anti-CTLA-4 régule la réponse immune via la cytokine anti-inflammatoire IL-10 et l’enzyme immunosuppressive IDO (Article 2). Ainsi, les résultats obtenus nous ont permis de répondre à notre objectif et de définir certains mécanismes de suppression des lymphocytes Tregs naturels et des lymphocytes Tregs induits. <p>Dans la dernière partie de ce travail, nous avons cherché à comparer les populations de lymphocytes Tregs naturels et ICOShigh présentes dans l’intestin d’une souris naïve. Une analyse transcriptomique a révélé que ces deux populations s’opposent sur les plans phénotypique et fonctionnel. Nous proposons un modèle dans lequel les deux populations de lymphocytes Tregs agiraient en synergie pour maintenir l’homéostasie intestinale. Les lymphocytes Tregs ICOShigh différenciés au niveau local et continuellement activés contrôleraient la réponse inflammatoire associée à la présence de la flore commensale. Les lymphocytes Tregs naturels, en quiescence dans les ganglions mésentériques, n’interviendraient qu’en cas d’infection par des pathogènes.<p>L’étude des lymphocytes T régulateurs soulève un certain nombre de concepts clés de l’immunité :la spécificité des réponses, la distinction des microorganismes commensaux et pathogènes… Mieux connaître les lymphocytes Tregs dans un modèle murin permettra de mieux comprendre les réponses inflammatoires intestinales chroniques observées chez l'homme et d’envisager, à terme, de nouveaux traitements.<p>/<p>An immune response is complex and implies numerous sequential events. It is regulated by different mechanisms, among which regulatory T cells maintain peripheral tolerance and control adaptive immune responses. Regulatory T cells are very heterogeneous and suppress immune responses through different mechanisms, still under investigation. They can inhibit T cell activation directly or through the modulation of dendritic cell function, depending on their nature and the tissular context.<p>In a dendritic cell-mediated immunization model, naturally occurring regulatory T cells selectively control the priming of antigen-specific Th1/CTL responses. Our goal was to define the potential actors of this control, targeted by natural regulatory T cells. Using the PC61 antibody which targets and depletes these cells, we showed that the costimulation ligand CD70 plays a key role in their control of Th1/CTL responses (first article). We showed that mainly IL-12 provokes Th1 development in normal conditions, wheras CD70 plays a major role in priming Th1 responses in the absence of natural Tregs. This pathway can be operational if regulatory T cells are destabilized or even depleted, for example during infection with Toxoplasma gondii or with HTLV1, SIV or HIV. We showed that natural Tregs downregulate CD70 expression on the surface of DCs.<p>Next, we focused on another regulatory T cell population, induced in vivo by the anti-CTLA-4 mAb treatment. In a model of pro-Th1 colitis, induced by the alkylating agent TNBS, these ICOShigh regulatory T cells exert an IL-10 and IDO-dependant control over the immune response (second article). Thus, we succeeded in determining some control mechanisms of the immune response targeted by two populations of regulatory T cells.<p>Finally, we compared two regulatory T cell populations: naturally occurring regulatory T cells and ICOShigh regulatory T cells from the intestines of naïve mice. A transcriptional analysis revealed two populations phenotypically and functionally distinct. We proposed a model in which these populations act synergistically and both maintain intestinal homeostasis. ICOShigh regulatory T cells might control commensal gut flora-specific inflammatory responses and quiescent natural regulatory T cells from mesenteric lymph nodes might control potential pathogen infections.<p>As a conclusion, this study raises some immunological issues: specificity of immune responses, distinction between commensal and pathogenic microorganisms… A better knowledge of these regulatory populations will lead to a better understanding of human intestinal responses and in the medium term will lead to new therapeutic approaches and tools.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les immunothérapies de type immune checkpoint blockade (ICB) ont révolutionné les approches thérapeutiques en oncologie médicale et ont largement contribué au fait que l’immunothérapie est maintenant considérée comme le quatrième pilier des traitements anticancer, aux côtés d’approches traditionnelles telles que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Malgré les résultats encourageants des études cliniques évaluant ce type d’immunothérapie, la majorité des patients décèderont des suites de leur maladie. Conséquemment, le domaine de recherche visant à comprendre les mécanismes de résistance aux immunothérapies est en expansion constante. Plusieurs stratégies visant à améliorer les issues cliniques ont été proposées, parmi lesquelles figurent: 1) la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques dans le microenvironnement immun tumoral et; 2) les études de combinaisons thérapeutiques où une immunothérapie est jumelée à d’autres types de modalités thérapeutiques potentiellement synergiques. Chacune des études présentées dans cette thèse de recherche s’apparente à l’une ou l’autre de ces stratégies. Dans le cadre de notre première étude, nous démontrons que la protéine WISP1 représente une cible prometteuse à l’intérieur du microenvironnement de plusieurs types de tumeurs solides étant donné son association avec différentes variables pronostiques et proinflammatoires, ainsi qu’avec un programme épigénétique complexe, la transition épithélialemésenchymateuse (Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT). De plus, nous démontrons que les niveaux d’expression de WISP1 sont significativement plus élevés au sein des tumeurs démontrant une résistance primaire aux immunothérapies de type ICB, particulièrement lorsque qu’une signature reliée à l’EMT peut être retrouvée de façon concomitante. Pour notre deuxième étude, nous avons utilisé des modèles murins in vivo de cancer pulmonaire non à petites cellules KRAS-mutés afin de tester différentes combinaisons thérapeutiques jumelant une thérapie dite ciblée (i.e., un inhibiteur de MEK) a différentes immunothérapies de type ICB. Nos résultats démontrent que l’ajout d’une immunothérapie anti-CTLA-4 à l’inhibiteur de MEK AZD6244 (selumetinib) et une immunothérapie anti-PD-L1 augmente significativement la survie, et que ces bénéfices sont associés à une diminution de marqueurs reliés à l’EMT. Il existe donc un lien commun entre ces deux études qui repose sur l’importance de l’EMT comme facteur favorisant la résistance thérapeutique aux immunothérapies. De plus, nous démontrons pour la première fois que les bénéfices associés à la triple combinaison thérapeutique susmentionnée peuvent être corrélés à une diminution d’expression de marqueurs liés à l’EMT. Par conséquent, nos résultats sont discutés en tant que base potentielle pour de futures études visant à réduire la résistance thérapeutique reliée à l’EMT. Nous discutons également de la valeur translationnelle de nos résultats à travers le développement d’une étude clinique. / Immune checkpoint blockade (ICB) has revolutionized therapeutic approaches in the field of medical oncology and has largely contributed to the fact that immunotherapy is now being regarded as the fourth pillar of cancer treatment alongside surgery, radiotherapy and chemotherapy. Despite encouraging results from clinical trials using ICB, most patients ultimately relapse or succumb to their disease. Therefore, the field of immunotherapeutic resistance research is rapidly expanding. Many strategies to improve ICB responses have been undertaken, including: 1) the search for novel, actionable targets in the immune tumor microenvironment (TME) and; 2) therapeutic combination studies where an ICB backbone is combined with different, synergistic treatment modalities. Each of the studies presented in this research thesis embraces one of these strategies. In our first study, we show that WISP1 represents a promising TME target in multiple solid tumor types by demonstrating its association with prognostic and pro-inflammatory variables, as well as to a complex epigenetic program termed Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT). Furthermore, we show that increased WISP1 expression is associated to primary resistance to ICB, particularly when EMT-related signatures are found concomitantly. In our second study, we used in vivo mouse models of KRAS-mutant Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) to test different therapeutic combinations of targeted therapies (i.e., MEK inhibitor) and ICB. We found that the addition of anti-CTLA-4 ICB to MEK inhibitor AZD6244 (selumetinib) and anti-PD-L1 ICB increases survival, and that these benefits are associated with the downregulation of EMT-related markers. Therefore, there exists a common link between these studies, which relies on the significance of EMT as a detrimental factor within the TME and its association with ICB resistance. Moreover, we show for the first time that the benefits of ICB combination therapy can be associated to the downregulation of EMT markers in vivo. Consequently, we discuss how our results may constitute the basis for future work aiming at reducing EMT-mediated therapeutic resistance, as well as the translational relevance of our pre-clinical results through the development of a clinical trial.