La thérapie génique sans transfert de gène utilisant les endonucléases de restriction spécifiques est une des approches thérapeutiques qui visent à la mise au point d’un traitement curatif de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Afin de corriger le gène de la dystrophine avec les nucléases à doigt de zinc (ZFNs) en ciblant l’exon 50, nous avons produit les protéines ZFNs dans les bactéries et les avons purifiées. Les résultats obtenus après les essais in vitro montrent que les ZFNs produites reconnaissent d’une manière spécifique la séquence cible située au niveau de l’exon 50 du gène DYS et peuvent y générer d’une manière précise les coupures double-brin. Ils montrent également que les protéines ZFNs produites peuvent être transfectées, avec ou sans agent de transfection, dans les myoblastes des patients dystrophiques Duchenne en culture. / Gene therapy without gene transfer using specific restriction endonucleases is a therapeutic approaches aimed at the development of a cure for Duchenne muscular dystrophy (DMD). To correct the dystrophin gene with zinc finger nucleases (ZFNs) targeting exon 50of DYS gene, we produced ZFNs proteins in bacteria and purified them. The results obtained after in vitro assays show that ZFNs produced specifically recognize a target sequence located in exon 50 of the gene DYS and can be generated in a precise manner the double strand breaks. They also show that ZFNs produced proteins can be transduced with or without agent transduction, in cultured myoblasts of patients’ Duchenne dystrophy.

Les membres de la famille des GAT A sont des facteurs de transcription à doigt de zinc exprimés dans une grande variété de tissus. Les facteurs GAT A jouent des rôles essentiels dans l 'hématopoïèse, le développement cardiaque et la formation de l'endoderme et des gonades. La régulation de ces divers processus biologiques par les facteurs GA T A dans différents tissus, incluant le testicule, ne peut se faire sans l'aide d' autres partenaires. Mes travaux de thèse avaient donc pour but d' étudier l'expression et l' implication de partenaires transcriptionnels qui pourraient moduler l'activité des facteurs GA TA et conséquemment l'expression de gènes testiculaires. Des analyses de types hybridation in situ et d'immunohistochimie ont permis de mettre en évidence la présence du messager et de la protéine des cofacteurs Friend of GAT A (FOG) 1 et FOG2 tout au long du développement testiculaire .. Des transfections transitoires in vitro ont ensuite permis de constater que l'interaction physique entre les protéines FOG et les facteurs de transcription GA TA résulte en une inhibition de l'activité de promoteurs testiculaires régulés par les facteurs GA TA. Ainsi, les partenaires FOG seraient des répresseurs de l'activité des facteurs GA TA dans le testicule. Un nouveau partenaire pour les facteurs GATA, le récepteur nucléaire LRH-I/NR5A2, a aussi été identifié. J' ai montré qu'il interagit directement avec les facteurs GAT A4 et GAT A6 et que cette interaction se traduit par une synergie transcriptionnelle sur les gènes lnha et Cyp19al codant pour la sous-unité a de l'inhibine et l'enzyme stéroïdogénique aromatase respectivement. Les modifications posttraductionnelles sont d'autres moyens utilisés par la cellule pour moduler l'activité d'un facteur de transcription sur un gène. Notre laboratoire a montré que la phosphorylation du facteur GAT A4 par la protéine kinase A (PKA), en réponse à l' activation de la voie de signalisation de l' AMPc, augmente son activité transcriptionnelle sur le promoteur Star. Mes travaux ont révélé que la phosphorylation de GAT A4 et GATA6 par PKA permet aussi une stimulation accrue des promoteurs lnha et Cyp19al. 111 En somme, la présence des partenaires FOG 1, FOG2 et LRHl/NR5A2 dans le testicule de même que des modifications posttraductionnelles de type phosphorylation modulent le potentiel de transactivation des facteurs GA TA sur des promoteurs testiculaires. Ceci suggère que les facteurs de transcription GATA et leurs partenaires sont d'importants régulateurs du développement et de la fonction testiculaire.

D'après notre stratégie de clonage, nous avons obtenu des protéines recombinantes dérivées de la PARP-1 correspondantes au premier doigt de Zn (Znl), au deuxième doigt de Zn (Zn2), au troisième doigt de Zn (Zn3), au domaine DB-WRG-CAT et au domaine WRG-CAT. Pour démontrer que Znl et Zn2 interagissent avec l'ADN simple brin nous avons utilisé des essais de retard sur gel (EMSA). Nos résultats suggèrent que Znl et Zn2 ont la capacité de se lier à l'ADN simple brin avec une haute préférence pour poly (dA), poly (T) et poly (dC). Parmi les sondes d'ADN simple brin, Zn3 a montré une affinité pour poly(T), poly(dG) et poly(dC). Remarquablement, Zn3 a montré une forte Uaison aux sondes d'ARN. Ce résultat nous pennet de suggérer un rôle de Zn3 dans le processus de transcription. L'enzyme pourrait être en contact avec des hybrides ARN-ADN lors de ce processus. Cependant le rôle précis de Zn3 reste encore à établir. Les doigts de Znl, Zn2 et Zn3 ainsi que le fragment WGR-CAT n'ont montré aucune affinité pour l'ADN double brin. Par ailleurs, nous avons clone une région de 60 acides aminés situés entre le domaine BRCT et le domaine WRG de la protéine PARP-1; nous l'avons baptisée région DB. Le fragment DB-WRG-CAT a montré une forte affinité par l'ADN double brin. Ce résultat suggère que la région DB est responsable de l'interaction de la protéine PARP-1 avec l'ADN double brin. Pour déterminer si la PARP-1 se lie à une structure de l'ADN simple brin et double brin, et pour démontrer si cette interaction est capable d'activer l'enzyme, nous avons construit différentes structures d'ADN qui comportent une boucle d'adénine ou de thymidine. Nos résultats suggèrent que l'ADN qui comporte une jonction entre simple et double brin agit comme un activateur potentiel de la PARP-1. Finalement, nous proposons un modèle qui pennet de comprendre l'interaction de la PARP-1 avec l'ADN qui est retrouvé dans plusieurs processus biologiques.

La PARP-1 est une enzyme modulaire très conservée, dont la structure comprend: 1) un domaine amino-terminal de liaison à l'ADN (DBD), contenant un signal de localisation nucléaire et trois doigts de zinc Znl, Zn2 et le Zn3 récemment découverts, ces trois doigts agissent comme détecteur moléculaire de cassures dans l'ADN; 2) un domaine régulateur central contenant un motif BRCT et des sites accepteurs de poly (ADP-ribose) permettant d'inactiver la PARP-1 (réaction d'automodification) ; et 3) un domaine carboxy-terminal catalytique renfermant le site actif. Dans notre étude, après avoir clone différentes protéines recombinantes par PCR, nous avons fait des essais de poly (ADP) ribosylation sur des extraits crus des cellules. En outre, nous avons fait des essais de retardement sur gel (EMSA) avec des oligonucleotides pour évaluer les interactions des peptides, correspondants aux fragments du domaine DBD, avec ces oligonucleotides afin d'essayer d'expliquer le mode d'activation de l'enzyme.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2024 / Les cancers sont l'une des causes principales de décès dans le monde et leur incidence est en augmentation constante. Ces maladies complexes se caractérisent par une prolifération excessive de cellules anormales ayant la capacité d'envahir d'autres tissus. De ce fait, les mécanismes régulant la prolifération dans les cellules sont inévitablement altérés dans les cancers. Malgré les grandes avancées dans le traitement de ces maladies et leurs impacts positifs sur la survie des patients, il existe toujours des cancers pour lesquels aucun traitement n'est disponible. De plus, lorsque des traitements sont disponibles, ceux-ci arrêtent fréquemment de fonctionner dû au développement de résistance et peuvent mener à un éventail de toxicité et effets secondaires. Ces phénomènes sont les principaux facteurs limitant dans le traitement des cancers. Il est donc primordial de continuer d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour mieux traiter ces maladies. ZNF768 est une protéine à doigts de zinc encore peu caractérisée dans la littérature. En 2021, cette protéine fut identifiée comme un nouvel acteur dans la réponse cellulaire au stress par l'équipe du Dr Laplante dans un article publié à *Nature Communications*. Cette protéine, dont l'expression est altérée dans les tumeurs, régule la prolifération et l'activation de p53 en réponse au stress génotoxique dans les cellules. Il est donc possible que l'altération de ZNF768 dans les cancers soit un des mécanismes permettant la prolifération aberrante des cellules dans ces maladies. L'objectif de cette thèse visait à définir les fonctions de ZNF768 *in vivo* dans le but de mieux comprendre ses fonctions physiologiques et pathologiques avec une emphase particulière sur le cancer. Les travaux décrits dans cette thèse ont démontré que le lien établi entre le stress génotoxique, la déplétion de ZNF768 et l'activation de p53 *in vitro* se produit également *in vivo* chez la souris. Démontrant un rôle direct de ZNF768 dans la réponse au stress génotoxique, la perte de ZNF768 altère la réponse à l'irradiation chez la souris. Comparativement aux souris sauvages, les souris ZNF768 knockout montrent une radiosensibilité accrue et une augmentation de l'expression de certaines cibles de p53 dans les tissus après l'irradiation. Nos travaux ont également établi que la surexpression de ZNF768 est un phénomène commun dans les cancers chez l'humain et la souris. De plus, les niveaux de ZNF768 corrèlent avec certaines caractéristiques des tumeurs avancées dont les marqueurs prolifératifs Ki-67 et le score mitotique dans les adénocarcinomes pulmonaires humains et le grade des tumeurs dans les adénocarcinomes pulmonaires murins. La délétion complète de ZNF768 permet également de réprimer le développement d'adénocarcinome pulmonaire dans ce même modèle chez la souris. Globalement, les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à mieux définir les processus menant à la prolifération non-contrôlée des cellules cancéreuses en confirmant un rôle actif de ZNF768 dans la réponse au stress génotoxique et la tumorigenèse *in vivo*. / Cancer is one of the leading causes of death worldwide and its incidence is constantly increasing. This complex disease is characterized by the excessive proliferation of abnormal cells that acquire the capacity to invade other tissues. Hence, the mechanisms regulating proliferation are inevitably altered in cancer. Despite the incredible advances in cancer treatment and their positive impact on patient survival, there still exists cancers for which no treatment is available. Furthermore, when treatments are available, they almost always stop working due to the development of resistance by clonal cells and can lead to the development of a range of side-effects and toxicities. These effects are the main limiting factors in cancer treatment. Therefore, it is essential to continue the search for novel therapeutic targets to better treat cancer. ZNF768 is a zinc finger protein that is still poorly characterized in the literature. This protein was identified as a novel actor in the cellular stress response in a study published in 2021 by Dr. Laplante in *Nature Communications*. This protein regulates proliferation and p53 activation in response to genotoxic stress in cells. Furthermore, ZNF768 expression is elevated in tumors suggesting that ZNF768 overexpression might be a mechanism supporting proliferation in cancer cells. The main objective of this thesis was to define the *in vivo* functions of ZNF768 to better understand its physiological and pathological functions with an emphasis on cancer. The work of this thesis demonstrated that the established link between genotoxic stress, ZNF768 depletion and p53 activation observed *in vitro* also happens *in vivo* in mice. Showing a direct role of ZNF768 in the response to genotoxic stress, ZNF768 loss alters the response to irradiation in mice. In comparison to wild-type mice, ZNF768 knockout mice show increased radiosensitivity and increased expression of some p53 targets in tissues following irradiation. Our work also establishes that ZNF768 overexpression is a frequent event in cancer in mice and humans. Furthermore, ZNF768 levels correlate with some characteristics of advanced tumors including Ki-67 and the mitotic score in human lung adenocarcinoma and with tumor grade in murine lung adenocarcinoma. ZNF768 loss also represses lung adenocarcinoma development in this same model in mice. Globally, the results presented in this thesis contributed to a better understanding of the processes leading to uncontrolled proliferation in cancer cells by establishing a direct role of ZNF768 in the response to genotoxic stress and tumorigenesis *in vivo*.