La protéine de rotavirus NSP3 est impliquée dans l’inhibition de la traduction des ARNm cellulaires polyadénylés et dans la stimulation la traduction des ARNm viraux lors de l’infection par le rotavirus. Ces deux fonctions de NSP3 ont été établies principalement par des essais in vitro et ont été en partie contestées par des expériences utilisant des siRNA sur des cellules infectées. L'objectif de mon travail de thèse a été de mettre au point un essai de traduction in vivo permettant de quantifier l’effet de NSP3 sur la traduction des ARNm viraux et des ARNm cellulaires. Plus particulièrement, nous avons voulu évaluer la part de la circularisation des ARNm (“close loop” : modèle d’initiation de la traduction eucaryote) et de la simple protection de l’ARN sur l‘expression des gènes viraux. Des essais de transfection d’ARN rapporteurs polyadénylés en cellules infectées par le rotavirus m’ont permis de montrer que l’infection par le rotavirus inhibe bien la traduction des ARNm cellulaires mais que la force de cette inhibition est dépendante de la souche de rotavirus utilisée. Parallèlement, j’ai pu montrer que l’infection par le rotavirus stimule bien la traduction d’ARN rapporteurs se finissant par GACC (pseudoviraux) et que l’expression de NSP3 seule est suffisante pour obtenir cette stimulation. La surexpression de NSP3 sauvage ou mutée suivie d’électroporations d’ARN rapporteur pseudoviraux dans des cellules BSR m’ont permis de montrer qu’une petite quantité de NSP3 (difficilement détectables par immunodétection) est suffisante pour induire une bonne stimulation de la traduction. Une analyse par RT-qPCR a permis de montrer que la stabilisation de l’ARN seule ne rend pas compte de la totalité de la stimulation de la traduction des ARNm viraux obtenue avec la protéine NSP3 entière. Par contre, j’ai observé que l’expression de NSP3 (en dehors d’une infection) provoque une augmentation non spécifique de la traduction des ARN quelles que soient leurs extrémités 3’. Ainsi, le blocage de la traduction des ARNm cellulaires au cours de l’infection ne dépend pas uniquement de la protéine NSP3. Enfin, la mise au point de ce système de traduction in vivo m’a permis de montrer que : 1/ seule l’extrémité 3’ GACC permet une forte stimulation de la traduction par NSP3 ; 2/ mis à part des contraintes extrêmes (longueurs très courtes des parties non codantes (UTR)), la traduction dépendante de NSP3 s’effectue correctement quels que soient les UTR sur l’ARN. / The rotavirus protein NSP3 is involved in the translation inhibition of polyadenylated cellular mRNAs and translation stimulation of viral mRNAs. These two functions of NSP3 have been established mainly by in vitro assays, then challenged by experiments using siRNA on cells infected. The objective of my thesis was to develop an in vivo translation assay to quantify the effect of NSP3 on the translation of viral and cellular mRNAs. More specifically, we wanted to assess the role of the circularization of mRNA ("closed loop" model of eukaryotic translation initiation) and the simple protection of the RNA on the expression of viral genes.Transfections of polyadenylated reporters RNA in infected cells showed that rotavirus infection inhibits the translation of cellular mRNAs and that the strength of this inhibition depends on the rotavirus strain used. Meanwhile, I was able to show that rotavirus infection stimulates strongly the translation of reporter RNA with a 3’ end GACC (viral-like) and that the expression of the sole NSP3 is sufficient for this stimulation. Overexpression of wild-type or mutated NSP3s followed by electroporation of viral-like reporter RNA in BSR cells showed that a small amount of NSP3 (hardly detectable by immunodetection) is sufficient to induce a good stimulation of translation. Moreover, quantification of transfected RNA by qRT-PCR showed that stabilization of the RNA does not only account for the totality of the stimulation of viral mRNA translation observed with NSP3wt. On the other hand, expression of NSP3 (without infection) causes a nonspecific increase of RNAs translation whatever their 3' ends. Thus, blocking the translation of cellular mRNAs during infection does not depends on the sole NSP3.Finally, the use of the in vivo translation system allowed me to show that 1/ only a 3' end GACC induces a strong stimulation of translation by NSP3 ; 2/ except for extreme constraints (like very short lengths of noncoding regions), NSP3-dependent translation works fine regardless of the UTR sequence.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014PA114825 |
| Date | 29 September 2014 |
| Creators | Gratia, Matthieu |
| Contributors | Paris 11, Poncet, Didier |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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