Beaucoup de médicaments anticancéreux entrainent à plus ou moins long terme une cardiotoxicité, dont les mécanismes moléculaires restent encore très mal connus. Aujourd'hui, peu de moyens existent pour prédire, au stade du développement préclinique, le potentiel cardiotoxique de ces molécules. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le principe de transfert d'énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour créer des biosenseurs de l'activité des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe IB. En effet, ces protéines kinases ubiquitaires sont des cibles pharmacologiques majeures de part leur implication dans les phénomènes cancéreux, et sont également importantes pour l'homéostasie cardiaque. Ainsi, elles pourraient constituer une cible cardiaque des agents anticancéreux participant au développement de la cardiotoxicité. Les PI3K-IB sont des hétérodimères formés d'une sous-unité catalytique (C) p110y associée à une sous-unité régulatrice (R) dont il existe deux isoformes, p87 et p101. Pour développer le senseur PI3Ky, un donneur (Rluc8) et un accepteur (GFP2) d'énergie BRET ont été fusionnés en position N- ou C-terminale de chacune des sous-unités C et R (senseur intermoléculaire). Après vérification de l'expression cellulaire de ces constructions dans les cellules HEK293T, les interactions entre les différentes paires de senseurs BRET (8 combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche d'un couple capable de refléter l'activation de la PI3K. Nos résultats démontrent des interactions spécifiques basales entre les sous-unités C et R des couples p110y-p87 et p110y-p101. Par contre, aucune des conditions de stimulations testées (nature du récepteur, concentrations de ligand, temps de stimulation, stœchiométrie des senseurs) n'a permis de détecter des modulations du signal BRET. La présence de co-activateurs connus de la PI3Ky tels que les protéines Ras ou les protéines G hétérotrimériques n'a pas non plus aidé à la modulation du signal BRET. Nous avons ensuite tenté de créer un senseur indirect de l'activité de la PI3Ky en mesurant par BRET les interactions entre les sous-unités de PI3K et des protéines G (décrites dans la littérature) lors de l'activation de la PI3Ky. Étonnamment, les résultats révèlent une pré-association basale entre les sous-unités de la PI3Ky et celles des protéines G mais sans détection de modulation significative de signal BRET après stimulation. En conclusion, nous n'avons pu établir un biosenseur BRET de l'activité de la PI3Ky en mesurant les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques. Ainsi, l'absence de modulations détectables du signal BRET après stimulation entre les deux sous-unités pré-complexées pourrait rendre compte d'un mécanisme d'activation impliquant des changements conformationnels plutôt qu'une association-dissociation physique. Dans le futur, l'étiquetage intramoléculaire des sous-unités C ou R avec les deux sondes BRET pourrait peut-être mieux détecter ces conformations et l'activité de la PI3Ky. D'un point de vue fondamental, l'existence de pré-complexes PI3Ky-protéines G pourraient également rendre compte d'une régulation spatio-temporelle plus fine et spécifique de la kinase, en accord avec les récents concepts de modules de signalisation préformés. / Cardiotoxicity is a recognized long-term consequence of a lot of anticancer drugs, but its mechanisms are not well-known. To date, the cardiotoxic potential of anticancer drugs is difficult to predict during preclinical studies due to the lack of appropriate tools. In this context, the aim of this thesis project was to develop biosensors, based on the use of bioluminescent resonance energy transfer (BRET) principle, to measure class IB phosphoinositide-3-kinases (PI3K) activity. Indeed, these ubiquitous kinases are major pharmacological oncotargets due to their participation in cancer development, but they also have a preponderant role in cardiac homeostasis. Thus, they could represent cardiac targets for anticancer drugs participating in the development of cardiotoxicity.PI3K-IB are heterodimers of a catalytic subunit (C) p110y and a regulatory subunit (R) p87 or p101. To develop the PI3Ky sensor, BRET energy donor (Rluc8) and acceptor (GFP2) were fused at the N-terminal or C-terminal of each subunit (intermolecular sensor). After expression control of each probe in HEK293T cells, the interactions between C and R subunits for all BRET pairs (8 combinations) were studied, in living cells in real time, so to find one able to sense PI3Ky activation. Our results indicated specific basal interaction between C and R subunits from p110y-p87 and p110y-p101 pairs. However, none of the stimulation conditions tested (receptor nature, ligand concentration, stimulation kinetics and biosensor stoichiometry) allowed the detection of BRET signal modulation. Further addition of p110y co-activators such as Ras proteins or heterotrimeric G proteins, did not improve BRET modulation. We then tried to create an indirect BRET sensor of PI3Ky activity by measuring the interaction between PI3K and G proteins subunits, known to occur during PI3Ky activation. Surprisingly, results highlighted a basal pre-association of PI3Ky and G protein subunits without BRET modulations upon PI3Ky stimulation.In conclusion, we failed to create a BRET biosensor of the PI3Ky activity based on the measure of the interaction between the catalytic and regulatory subunits. However, the pre-association of PI3K subunits without BRET modulation could reflect a mechanism of PI3Ky activation based on conformationals changes of the complex between C and R subunits rather than physical association-dissociation. In the future, intramolecular labeling of the C or R subunit with the two BRET probes could better detect conformational changes and therefore PI3Ky activity. From a fundamental standpoint, the existence of PI3Ky-G proteins pre-complexes could reflect a specific spatio-temporal fine-tuning of the PI3K activity, in agreement with recent concept of preformed cell signaling platforms.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016TOU30071 |
| Date | 01 July 2016 |
| Creators | Onfroy, Lauriane |
| Contributors | Toulouse 3, Galès, Céline, Senard, Jean-Michel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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