Beaucoup de médicaments anticancéreux entrainent à plus ou moins long terme une cardiotoxicité, dont les mécanismes moléculaires restent encore très mal connus. Aujourd'hui, peu de moyens existent pour prédire, au stade du développement préclinique, le potentiel cardiotoxique de ces molécules. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le principe de transfert d'énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour créer des biosenseurs de l'activité des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe IB. En effet, ces protéines kinases ubiquitaires sont des cibles pharmacologiques majeures de part leur implication dans les phénomènes cancéreux, et sont également importantes pour l'homéostasie cardiaque. Ainsi, elles pourraient constituer une cible cardiaque des agents anticancéreux participant au développement de la cardiotoxicité. Les PI3K-IB sont des hétérodimères formés d'une sous-unité catalytique (C) p110y associée à une sous-unité régulatrice (R) dont il existe deux isoformes, p87 et p101. Pour développer le senseur PI3Ky, un donneur (Rluc8) et un accepteur (GFP2) d'énergie BRET ont été fusionnés en position N- ou C-terminale de chacune des sous-unités C et R (senseur intermoléculaire). Après vérification de l'expression cellulaire de ces constructions dans les cellules HEK293T, les interactions entre les différentes paires de senseurs BRET (8 combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche d'un couple capable de refléter l'activation de la PI3K. Nos résultats démontrent des interactions spécifiques basales entre les sous-unités C et R des couples p110y-p87 et p110y-p101. Par contre, aucune des conditions de stimulations testées (nature du récepteur, concentrations de ligand, temps de stimulation, stœchiométrie des senseurs) n'a permis de détecter des modulations du signal BRET. La présence de co-activateurs connus de la PI3Ky tels que les protéines Ras ou les protéines G hétérotrimériques n'a pas non plus aidé à la modulation du signal BRET. Nous avons ensuite tenté de créer un senseur indirect de l'activité de la PI3Ky en mesurant par BRET les interactions entre les sous-unités de PI3K et des protéines G (décrites dans la littérature) lors de l'activation de la PI3Ky. Étonnamment, les résultats révèlent une pré-association basale entre les sous-unités de la PI3Ky et celles des protéines G mais sans détection de modulation significative de signal BRET après stimulation. En conclusion, nous n'avons pu établir un biosenseur BRET de l'activité de la PI3Ky en mesurant les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques. Ainsi, l'absence de modulations détectables du signal BRET après stimulation entre les deux sous-unités pré-complexées pourrait rendre compte d'un mécanisme d'activation impliquant des changements conformationnels plutôt qu'une association-dissociation physique. Dans le futur, l'étiquetage intramoléculaire des sous-unités C ou R avec les deux sondes BRET pourrait peut-être mieux détecter ces conformations et l'activité de la PI3Ky. D'un point de vue fondamental, l'existence de pré-complexes PI3Ky-protéines G pourraient également rendre compte d'une régulation spatio-temporelle plus fine et spécifique de la kinase, en accord avec les récents concepts de modules de signalisation préformés. / Cardiotoxicity is a recognized long-term consequence of a lot of anticancer drugs, but its mechanisms are not well-known. To date, the cardiotoxic potential of anticancer drugs is difficult to predict during preclinical studies due to the lack of appropriate tools. In this context, the aim of this thesis project was to develop biosensors, based on the use of bioluminescent resonance energy transfer (BRET) principle, to measure class IB phosphoinositide-3-kinases (PI3K) activity. Indeed, these ubiquitous kinases are major pharmacological oncotargets due to their participation in cancer development, but they also have a preponderant role in cardiac homeostasis. Thus, they could represent cardiac targets for anticancer drugs participating in the development of cardiotoxicity.PI3K-IB are heterodimers of a catalytic subunit (C) p110y and a regulatory subunit (R) p87 or p101. To develop the PI3Ky sensor, BRET energy donor (Rluc8) and acceptor (GFP2) were fused at the N-terminal or C-terminal of each subunit (intermolecular sensor). After expression control of each probe in HEK293T cells, the interactions between C and R subunits for all BRET pairs (8 combinations) were studied, in living cells in real time, so to find one able to sense PI3Ky activation. Our results indicated specific basal interaction between C and R subunits from p110y-p87 and p110y-p101 pairs. However, none of the stimulation conditions tested (receptor nature, ligand concentration, stimulation kinetics and biosensor stoichiometry) allowed the detection of BRET signal modulation. Further addition of p110y co-activators such as Ras proteins or heterotrimeric G proteins, did not improve BRET modulation. We then tried to create an indirect BRET sensor of PI3Ky activity by measuring the interaction between PI3K and G proteins subunits, known to occur during PI3Ky activation. Surprisingly, results highlighted a basal pre-association of PI3Ky and G protein subunits without BRET modulations upon PI3Ky stimulation.In conclusion, we failed to create a BRET biosensor of the PI3Ky activity based on the measure of the interaction between the catalytic and regulatory subunits. However, the pre-association of PI3K subunits without BRET modulation could reflect a mechanism of PI3Ky activation based on conformationals changes of the complex between C and R subunits rather than physical association-dissociation. In the future, intramolecular labeling of the C or R subunit with the two BRET probes could better detect conformational changes and therefore PI3Ky activity. From a fundamental standpoint, the existence of PI3Ky-G proteins pre-complexes could reflect a specific spatio-temporal fine-tuning of the PI3K activity, in agreement with recent concept of preformed cell signaling platforms.

La doxorubicine induit un stress oxydant, des dommages à l’ADN conduisant aussi bien à la mort des cellules cancéreuses que des cardiomyocytes. De nos jours, plusieurs hypothèses non reliées à la mort cellulaire et impliquant d’autres mécanismes ou l’altération des signalisations cardiaques telles que la signalisation β-adrénergique ont émergé. Cette thèse a donc pour objectif l’étude du rôle d’Epac, facteur d’échange directement activé par l’AMP cyclique, lui-même produit après stimulation β-adrénergique, dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. En effet, la doxorubicine induit une cardiomyopathie dilatée 15 semaines après traitement associée à une altération de l’homéostasie calcique. Ces altérations sont corrélées à la modulation temps et dose-dépendantes de la signalisation d’Epac. Cette même altération globale de la signalisation d’Epac a également été observée in vitro après 24h de traitement à la dox. De plus, l’inhibition spécifique d’Epac 1 a permis la prévention des dommages à l’ADN et de façon subséquente de la mort des cardiomyocytes. L’invalidation du gène d’Epac1 chez la souris a également permis la prévention in vivo des altérations de l’homéostasie calcique ainsi que de la fonction cardiaque induite par la dox. Enfin, l’inhibition d’Epac n’interfère pas avec l’efficacité antitumorale de la doxorubicine sur différentes lignées cancéreuses. En conclusion, nous avons identifié Epac comme nouvelle cible thérapeutique de la cardiotoxicité induite par la dox permettant sa prévention sans réduire l’efficacité du traitement anticancéreux. / The mechanisms underlying doxorubicin (Dox)-induced cardiotoxicity involve reactive oxygen species generation, DNA intercalation and topoisomerase II (TopII) inhibition which trigger DNA damage, oxidative stress, alteration of calcium homeostasis and lead to cardiomyocyte death. Now, evidences have emerged that Dox may promote cardiotoxicity by alternative mechanisms or by signaling pathways modulation including β-adrenergic signaling unrelated directly to cell death. This study provides in vitro and in vivo evidence of the guanine exchange factor directly activated by Epac role, a guanine exchange factor directly activated by cyclic AMP produced after β-AR stimulation, in cardiotoxicity induced by doxorubicin. Indeed, Dox leads to the development of a dilated cardiomyopathy (DCM) 15 weeks post treatment in mice associated with calcium homeostasis abnormalities. These alterations were associated with time- and dose-dependent alterations of Epac signaling. The same alterations of Epac signaling were observed in vitro after 24h of dox treatment. Furthermore, we first showed that the specific pharmacologic or genetic inhibition of Epac1 but not Epac2 prevents the deleterious effects of Dox in vitro. These cardioprotection were confirmed in vivo in transgenic Knock-out Epac1 mice. Epac 1 inhibition did not interfere with the attempted Dox antitumor efficiency on tumor cell lines. Altogether, these findings identify the cAMP-binding protein, Epac, as a potential therapeutic target of dox-induced cardiotoxicity.

Abstract: Sunitinib (Sutent®) is a multitargeted, small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor used as an anti-cancer drug. It has increased the overall survival rate of metastatic renal cell carcinoma patients as well as the survival time of patients with pancreatic neuroendocrine tumors. Although the clinical use of sunitinib is a significant leap forward in the therapy of those cancers, its induction of cardiac toxicity in a substantial fraction of patients remains a critical problem. Sunitinib may cause hypertension, arrhythmias, drop of the left ventricular ejection fraction and congestive heart failure, fatal in some cases. These side effects are a frequent reason for interruption of its use. The mechanism(s) underlying sunitinib cardiotoxicity are not fully understood. Similar to other receptor tyrosine kinase inhibitors, it binds to a large number of cellular kinases, thus it can affect multiple cellular processes. In vivo, the pattern of toxicity is complex and unpredictable, with symptomatic heart failure sometimes observed early during treatment. The pattern of events preceding the onset of symptomatic cardiac dysfunction during treatment is not established. This represents a significant problem for the clinical diagnosis of cardiovascular complications before they become symptomatic. The identification and early detection of those events would be highly-beneficial for the clinical management of anti-cancer therapy with sunitinib. Positron Emission Tomography (PET) is recognized for its ability to probe metabolic and functional aspects of myocardial function. Under the working concept that heart failure can occur early during sunitinib treatment, and may be sustained by early myocardial metabolic and structural alterations, we performed a study with the objective of assessing the use of PET for the early detection of sunitinib-induced ardiotoxicity. For this, we established a model of cardiotoxicity in C57BL/6 male mice given 80mg/Kg/day of sunitinib or water, orally for 4 weeks. General and cardiac toxicity were monitored by biochemical, microscopical (H&E, immunofluorescence and electron microscopy) as well as gene expression analyses and blood pressure measurements. PET scans were performed weekly using [superscript 11]C-acetate and [superscript 18]F-FDG to evaluated the myocardial blood flow (MBF), myocardial oxidative metabolism through the quantification of oxygen consumption (MVO[subscript 2]), glucose uptake (K[subscript i]), myocardial metabolic rate of glucose (MMRG) and the left ventricular ejection fractions (LVEF). We found that sunitibib was cardiotoxic as revealed by histopathology, immunostaining and electron microscopy. Signs of inflammation and tissue remodeling were found by gene expression analyses and collagen staining. No hypertension or renal damage were detected on the study. FDG-PET revealed an early decrease of the LVEF, indicative of cardiac dysfunction, which developed into grade-2 heart failure by the end of the study. However, no signs of alterations in cardiac metabolism were uncovered by FDG- or [superscript 11]C-acetate-PET. Our results hint that the onset of sunitinib-induced contractile dysfunction may occur in the absence of hypertension or overt metabolic damage and call for further studies with longer treatments to clearly mark the onset of metabolic cardiotoxicity. // Résumé: Le sunitinib est un inhibiteur de tyrosine kinase qui est utilisée comme agent anticancéreux. Bien que l'utilisation clinique du sunitinib représente une percée significative pour le traitement de certains cancers, ce médicament s’avère cardiotoxique chez plusieurs patients, une situation qui est problématique. Le sunitinib peut provoquer une hypertension, des arythmies, une chute de la fraction d'éjection ventriculaire gauche et une insuffisance cardiaque congestive qui peut être fatale. Le mécanisme responsable de la cardiotoxicité de sunitinib n’est pas encore bien compris. Comme plusieurs autres inhibiteurs des récepteurs de la tyrosine kinase, il se lie à un grand nombre de kinases et peut affecter de nombreux processus cellulaires. In vivo, les mécanismes responsables de la toxicité sont complexes et imprévisibles et une insuffisance cardiaque est parfois observée tôt pendant le traitement. La séquence des évènements menant à l'apparition d’une dysfonction cardiaque pendant le traitement n’est pas connue. Cela pose un problème important pour le diagnostic de complications cardiovasculaires avant qu'elles ne deviennent symptomatiques. Une identification précoce de ces événements néfastes serait très bénéfique pour le suivi du traitement au sunitinib. La tomographie d'émission par positrons (TEP) est une méthode reconnue pour l’évaluation du métabolisme et de la fonctionnalité du myocarde. Selon notre hypothèse de travail, une insuffisance cardiaque peut survenir rapidement pendant le traitement au sunitinib, elle est l’expression d’altérations structurelles et métaboliques au niveau du myocarde; ces modifications se produisent tôt pendant le traitement. Nous avons effectué une étude pour évaluer la faisabilité d’utiliser l’imagerie TEP pour la détection précoce de la cardiotoxicité induite par le sunitinib. La première étape a été de développer un modèle de cardiotoxicité chez des souris. L’induction de la cardiotoxicité s’est faite par administration orale pour une période de quatre semaines, soit de sunitinib 80mg/Kg/jour ou d'eau pour les souris contrôles. Le suivi inclut la mesure de la pression sanguine, l’évaluation des altérations biochimiques, l’expression de certains gènes et un examen histologique du myocarde. Un suivi par imagerie TEP a été effectué chaque semaine avec du [indice supérieur 11]C-acétate et du [indice supérieur 18]F-FDG afin d'évaluer le flux sanguin myocardique (MBF), le métabolisme oxydatif du myocarde incluant la consommation d'oxygène (MVO2), l'absorption du glucose (K[indice inférieur i]), le taux métabolique oxydatif du glucose (MMRG) ainsi que la fraction d'éjection ventriculaire gauche (FEVG). Les résultats que nous avons obtenus par histopathologie, immunocoloration et microscopie électronique montrent que notre modèle est capable d’induire une cardiotoxicité. Nous avons également observé des évidences d'inflammation et de remodelage tissulaire à partir de l’étude de l'expression de certains gènes et de l’analyse de l’accumulation de collagène. Nous n’avons pas observé d’hypertension ni de lésions rénales. La TEP avec [indice supérieur 18]FDG a montré une diminution rapide de la FEVG, une indication d’une dysfonction cardiaque qui a été classée comme insuffisance cardiaque de grade 2 à la fin de l'étude. Cependant, aucun signe de modifications du métabolisme cardiaque n’a été mis en évidence par TEP/[indice supérieur 18]FDG- ou TEP/[indice supérieur 11]C-acétate. Nos résultats laissent penser que l'apparition de la dysfonction contractile induite par sunitinib peut se produire en l'absence d'hypertension ou de dommages métaboliques manifestes. De nouvelles études avec des traitements plus longs permettraient peut être de mieux définir le début de la cardiotoxicité métabolique.

La doxorubicine (DOX) est un médicament très efficace utilisé en chimiothérapie pour traiter de nombreuses tumeurs. Cependant, son utilisation clinique est limitée par des effets secondaires cardiotoxiques sévères causés par une augmentation de production de radicaux libres de l'oxygène (RLO) et de l'apoptose. De surcroit, une chimiothérapie pourrait être indiquée alors qu'une ischémie cardiaque est déjà installée. Dans cette thèse, nous avons donc examiné au niveau du cœur isolé de lapin et des cardiomyocytes en culture; d'une part, la cardiotoxicité de la DOX dans les conditions de l'ischémie/reperfusion (IR) myocardique et d'autre part, la cardioprotection assurée dans ces conditions par un antioxydant naturel puissant, le safran (SAF).D'abord nous avons procédé à une extraction méthanol-Eau des stigmates du safran cultivé au Liban. Une analyse par HPLC des principaux constituants a été réalisée afin de s'assurer de la qualité des extraits, suivie par des tests (xanthine/xanthine oxydase et électrolyse) comme sources de RLO pour rechercher le pouvoir antioxydant de ces extraits.La toxicité du SAF a été évaluée sur des cœurs isolés de lapin selon la technique de Langendorff et la dose thérapeutique optimale établie est de 10 μg/mL. Ensuite, la toxicité aigüe de la DOX a été testée sur des cœurs isolés sains traités ou non par la DOX et le SAF en comparaison avec des cœurs soumis à l'électrolyse ou à une période d'ischémie globale. La toxicité chronique de la DOX a été évaluée chez des lapins traités pendant 21 jours avec des extraits de SAF (par voie orale) et la DOX (par voie ip). Les cœurs ont été par suite isolés et soumis à une ischémie globale. D'après les études cardiodynamiques, anatomopathologiques et biochimiques; il apparaît que les extraits de safran protègent le cœur de la toxicité aigüe et chronique de la doxorubicine et assurent une protection optimale lors de la reperfusion. De plus, le SAF a inhibé l'apoptose induite par IR et DOX en activant la voie de survie AKT/mTOR, en augmentant le niveau de Troponine T et en inhibant l'expression de p-P38 tel que montré par les analyses de Western blot. Le safran contribuerai donc à améliorer nettement le retour des fonctions myocardiques vers la normale suite à l'IR et au traitement par la DOX.Les effets de la DOX et du SAF ont aussi été étudiés dans les cardiomyocytes H9c2 soumis à une IR simulée. Les effets des différents traitements ont été évalués par les tests MTT, LDH, Western blot, TMRM et caspases. Nos données prouvent que DOX et IR diminuent significativement la viabilité cellulaire ; inhibent la voie RISK ; réduisent les protéines contractiles ; activent les caspases 3 et provoquent la perte du potentiel de membrane mitochondrial. Ces effets ont été remarquablement inhibés par le traitement avec le SAF à la reperfusion. Les résultats suggèrent que le SAF a un effet protecteur contre la DOX et l'IR par un mécanisme impliquant la réduction de l'apoptose cardiaque, des RLO et du stress oxydatif. La cardioprotection du SAF est médiée par l'activation des voies de survie AKT/P70S6K et ERK ; augmentation de l'expression des protéines contractiles ; inhibition de la perméabilité des pores de transition mitochondrial et diminution de l'activité des caspases 3. En outre, nous avons montré que l'effet protecteur du SAF serait attribué à la crocine, son métabolite actif principal. Pris ensemble, nos résultats indiquent que la DOX exacerbe les lésions myocardiques de l'IR. Le traitement par le SAF à la reperfusion pourrait exercer des effets cardioprotecteurs contre la toxicité induite par la DOX via son activité antioxydante. Ainsi, nos travaux sur le safran se révèlent fort intéressants dans le développement d'une stratégie thérapeutique antioxydante potentielle afin de limiter la toxicité cardiaque de la DOX, ouvrant la voie à de futurs essais cliniques. / Doxorubicin (DOX) is a highly active chemotherapeutic drug used to treat many tumors. However, its clinical use is limited by severe cardiotoxic side effects. Previous studies have shown that DOX-Induced cardiotoxicity is mainly mediated through increased oxidative stress and apoptosis. In addition, DOX could be indicated in case of pre-Established myocardial ischemia. In this thesis we investigated, in isolated rabbit heart and cultured cardiomyocytes, the cardiotoxic effects of DOX in conditions of ischemia/reperfusion (IR). We also studied whether saffron (SAF), a natural compound that showed potent antioxidant activity, could exert cardioprotection against DOX and IR toxicity.First, the extraction of saffron stigmas grown in Lebanon was performed using methanol-Water mixture. HPLC analysis of the main components (safranal and crocines) was used to ensure the quality of the extracts; followed by tests (xanthine/xanthine oxidase and electrolysis) as sources of free radicals to determine the antioxidant activity of the sample.The toxicity of SAF was evaluated on isolated rabbit hearts according to Langendorff technique and the optimal therapeutic dose established is 10 μg/mL. Then, the acute toxicity of DOX was tested on isolated hearts treated with or without DOX and SAF compared with hearts subjected to electrolysis or a period of global ischemia (I 30 min/R 40 min). The chronic toxicity of DOX was evaluated in rabbits treated for 21 days with SAF extracts (orally) and DOX (ip). The hearts were afterward isolated and subjected to global ischemia (I 30 min/R 30 min). According to cardiodynamic, pathological and biochemical studies, it appears that saffron extracts protect the heart from the acute and chronic toxicity of doxorubicin, and ensure optimal protection during reperfusion. Furthermore, SAF inhibited IR and DOX-Induced apoptosis by activating the AKT/mTOR survival pathway, increasing Troponine T and inhibiting p-P38 expression as shown by Western blot analysis. Saffron could therefore significantly improve myocardial function to normal state following IR and DOX treatment.The effects of DOX and SAF were also investigated in H9c2 cardiomyocytes subjected to simulated IR injury. We evaluated the effects of the treatments by MTT assay, LDH release measurements and Western blot analysis. Apoptosis was assessed by Hoechst 33258 staining, TMRM probes and caspase activity. The results proved that DOX exacerbates cardiac cell injury when an underlying IR heart condition is present. Our data showed that DOX and IR significantly decreased cardiac cells viability; inhibited RISK cardioprotective pathway; reduced contractile proteins (α-Actinine, Troponine C and MLC); increased caspase 3 expression and induced loss of mitochondrial membrane potential. These effects were remarkably inhibited by treatment with SAF (10 μg/mL) at reperfusion. Our data suggested that SAF has a protective effect against DOX and IR induced cardiac apoptosis through a mechanism involving scavenging free radicals and reducing oxidative stress. SAF cardioprotection is mediated by activating survival pathways including AKT/P70S6K and ERK; increasing the expression of contractile proteins; inhibiting of mitochondrial permeability transition pore and decreasing caspase 3 activity. In addition, studies showed that protective activities of SAF belong to crocin, its major active metabolite.Taken together, our findings indicate that DOX exacerbates IR myocardial injury. The SAF treatment at reperfusion could exert cardioprotective effects against DOX induced toxicity by its antioxidant activity. Thereby, saffron offers a potential novel antioxidant therapeutic strategy to counteract doxorubicin cardiotoxicity, paving the way for future clinical trials.

La doxorubicine (DXR) est l’un des médicaments les plus efficaces en chimiothérapie, mais sonapplication clinique est limitée par ses effets cardiotoxiques. Malgré des décennies de recherche, sesmécanismes pathogéniques ne sont toujours pas entièrement compris. Il s’ensuit qu’aucun traitementsatisfaisant, curatif ou préventif, n’existe. Dans cette étude, nous recherchons les mécanismes designalisation cellulaire impliqués. Deux modèles expérimentaux de toxicités, aigue d’une part (coeurisolé et perfusé de rat avec la DXR), et chronique d’autre part (rat traité à la DXR), ont permis deréaliser une étude ciblée (sur les voies de signalisation énergétiques) et deux études systémiques(phosphoprotéomique et transcriptomique). Les résultats combinés de ces travaux ont montré que laDXR modifiait le niveau de phosphorylation (activation) ou l’expression génique de protéinesimpliquées dans trois domaines fonctionnels distincts : métabolisme énergétique, réponses au stress,et structure/fonction du sarcomère. (i) Métabolisme énergétique : nous avons confirmé la surprenanteinhibition de l’AMPK, probablement provoquée par un contrôle négatif exercé par des partenaires designalisation (Akt et ERK), plutôt que par une modification des kinases activatrices en amont. Nousavons également montré l’augmentation du niveau de phosphorylation de la PDH, ce qui, en inhibantl’enzyme, ralentit le cycle de Krebs. Cependant, nous avons également observé un phénomènecompensatoire de surexpression de gènes codant pour des enzymes de la glycolyse et du cycle deKrebs ; (ii) Réponses au stress : dans nos modèles, la DXR génère des stress énergétique,génotoxique et oxydatif. Cependant, seuls quelques mécanismes compensatoires sont activés (lesvoies de signalisation de DNA-PK–Akt–GSK3, diverses chaperonnes). Les autres semblent êtreinhibées suggérant que l’amoindricement des réponses au stress serait un des mécanismes de lacardiotoxicité de la DXR; (iii) Structure/fonction du sarcomère: L’augmentation de la phosphorylationde la desmine ainsi que la réduction du nombre de transcrits codant pour des protéines essentiellesau développement cardiaque normal pourraient être la cause de la désorganisation du réseaumyofibrillaire. En conclusion, ces résultats révèlent potentiellement de nouveaux mécanismes de lacardiotoxicité induite par la DXR et permettent d’envisager de nouvelles cibles moléculaires pour ledéveloppement de stratégies protectrices. / Doxorubicin (DXR) is an efficient anticancer drug, the use of which is limited by seriouscardiotoxicity. Despite decades of research, its pathogenic mechanisms are not fully understood, andefficient preventive or curative strategies are not available. Here we address the question whethermechanisms in cardiac cell signaling contribute to the toxicity phenotype. Using experimental modelsfor acute (DXR-perfused, isolated rat hearts) or chronic toxicity (rats injected with DXR), we conducteda targeted study (focusing on energy signaling pathways) and two non-biased studies(phosphoproteomics and transcriptomics). The combined data reveal DXR-induced alterations inphosphorylation (activation) status or gene expression of proteins in mainly three functional domains:energy metabolism, stress responses, and sarcomere structure. (i) Energy metabolism: We confirm aparadox inhibition of AMPK signaling, that is rather due to inhibitory cross-talk with related signalingpartners (Akt, ERK) than impaired AMPK upstream signaling. We also show, among others, theincrease of inhibitory phosphorylation of pyruvate dehydrogenase, slowing down Krebs cycle, but alsoa compensating upregulation of glycolysis and Krebs cycle enzyme transcripts. (ii) Stress-responses:In our models, DXR generates energetic, oxidative and genotoxic stress, but only some compensatorystress responses are activated (DNA-PK–Akt–GSK3 pathway, chaperones). Many others seem to beinhibited, suggesting a blunted response to stress as component of DXR toxicity. (iii) Sarcomerestructure/function: We detect increased phosphorylation of desmin and reduced transcripts essentialfor e.g. normal heart development as potential causes for a disorganized myofibrillar network. Inconclusion, these results reveal some novel potential mechanisms of DXR-induced cardiotoxicity andsuggest new targets for protective strategies.

Les prokinéticines sont des hormones angiogéniques qui exercent leurs fonctions biologiques par l’intermédiaire de deux récepteurs couplés aux protéines G : PKR1 et PKR2. PKR1 a été révélé comme crucial dans l’homéostasie cardiovasculaire. L’objectif de ce projet de thèse était de développer un nouvel agoniste non–peptidique à PKR1 pour la cardioprotection et la régénération cardiaque. Les premiers résultats ont permis de caractériser le premier ligand spécifique à PKR1 : IS20. L’étude in vivo a démontré qu’IS20 est capable de prévenir les lésions après induction d’un infarctus du myocarde chez la souris. Ce composé améliore les fonctions cardiaques en activant la prolifération de cellules progénitrices cardiaques et la néovascularisation (Gasser et al, PlosOne, 2015). Dans une deuxième étude, nous avons évalué le potentiel cardioprotecteur d’IS20 face à la toxicité induite par la doxorubicine (DOX), un anticancéreux de la famille des anthracyclines très efficace mais cardiotoxique. Les résultats montrent qu’IS20 atténue l’apoptose des cardiomyocytes H9c2 et des cellules progénitrices humaines de types EPDC, induite par la doxorubicine, sans affecter la cytotoxicité de la doxorubicine sur les cellules cancéreuses. In vivo, le traitement par IS20 atténue la diminution de la prolifération provoquée par la doxorubicine dans un modèle de cardiotoxicité juvénile. Dans un modèle de cardiotoxicité chronique, IS20 maintient l’intégrité cellulaire et tissulaire des vaisseaux et protège des défaillances produites par DOX. Par ses effets cytoprotecteurs des cardiomyocytes et des cellules progénitrices cardiaques, l’IS20 présente un potentiel thérapeutique prometteur pour protéger les patients cancéreux des effets cardiotoxiques des anthracyclines. / Prokineticins are angiogenic hormones that activate two G protein-coupled receptors (GPCRs): PKR1 and PKR2. PKR1 has emerged as a critical mediator of cardiovascular homeostasis and cardioprotection. The aim of this thesis project was to develop a first non-peptide PKR1 agonist stimulates cardioprotection and cardiac regeneration in mouse model of myocardial infarction (MI) or anti-cancer drug mediated cardiotoxicity. Collaboration with chemist and biomodelization team, we characterized the first selective/specific PKR1 agonist, named IS20. In vivo study demonstrated IS20 prevented cardiac lesion formation and improved cardiac function after myocardial infarction in mice, promoting proliferation of cardiac progenitor cells and neovasculogenesis (Gasser et al., 2015). Since use of a very potent anthracycline chemotherapeutic, Doxorubicin (DOX) is limited by cardiotoxicity, we hypothesized that IS20 could protect heart against DOX-mediated cardiotoxicity. Indeed, IS20 attenuated apoptosis induced by DOX in H9c2 cardiomyocytes and human epicardial progenitors in vitro. However, IS20 did not affect antineoplastic or cytostatic effect of DOX in cancer cell lines. In vivo, in the juvenile model of cardiotoxicity, IS20 significantly attenuated DOX-induced decrease in viability and proliferation cardiac progenitor cells. In the chronic cardiotoxicity model by DOX, IS20 improves heart structure and function by the activation of cardiac progenitor cells, diminishing cardiac cell death, improving vascular stability. IS20 has translational potential for cardioprotection in patients with cancer receiving anthracyclines.

La doxorubicine (DXR) est l'un des médicaments les plus efficaces en chimiothérapie, mais sonapplication clinique est limitée par ses effets cardiotoxiques. Malgré des décennies de recherche, sesmécanismes pathogéniques ne sont toujours pas entièrement compris. Il s'ensuit qu'aucun traitementsatisfaisant, curatif ou préventif, n'existe. Dans cette étude, nous recherchons les mécanismes designalisation cellulaire impliqués. Deux modèles expérimentaux de toxicités, aigue d'une part (coeurisolé et perfusé de rat avec la DXR), et chronique d'autre part (rat traité à la DXR), ont permis deréaliser une étude ciblée (sur les voies de signalisation énergétiques) et deux études systémiques(phosphoprotéomique et transcriptomique). Les résultats combinés de ces travaux ont montré que laDXR modifiait le niveau de phosphorylation (activation) ou l'expression génique de protéinesimpliquées dans trois domaines fonctionnels distincts : métabolisme énergétique, réponses au stress,et structure/fonction du sarcomère. (i) Métabolisme énergétique : nous avons confirmé la surprenanteinhibition de l'AMPK, probablement provoquée par un contrôle négatif exercé par des partenaires designalisation (Akt et ERK), plutôt que par une modification des kinases activatrices en amont. Nousavons également montré l'augmentation du niveau de phosphorylation de la PDH, ce qui, en inhibantl'enzyme, ralentit le cycle de Krebs. Cependant, nous avons également observé un phénomènecompensatoire de surexpression de gènes codant pour des enzymes de la glycolyse et du cycle deKrebs ; (ii) Réponses au stress : dans nos modèles, la DXR génère des stress énergétique,génotoxique et oxydatif. Cependant, seuls quelques mécanismes compensatoires sont activés (lesvoies de signalisation de DNA-PK-Akt-GSK3, diverses chaperonnes). Les autres semblent êtreinhibées suggérant que l'amoindricement des réponses au stress serait un des mécanismes de lacardiotoxicité de la DXR; (iii) Structure/fonction du sarcomère: L'augmentation de la phosphorylationde la desmine ainsi que la réduction du nombre de transcrits codant pour des protéines essentiellesau développement cardiaque normal pourraient être la cause de la désorganisation du réseaumyofibrillaire. En conclusion, ces résultats révèlent potentiellement de nouveaux mécanismes de lacardiotoxicité induite par la DXR et permettent d'envisager de nouvelles cibles moléculaires pour ledéveloppement de stratégies protectrices.

Notre deuxième travail expérimental visait à élucider le rôle de la surcharge pondérale dans le développement de la cardiotoxicité des anthracyclines et du trastuzumab. Grâce à un modèle murin de surpoids modéré et de risque cardio-métabolique accru induits par programmation post-natale, nous avons mis en évidence le rôle potentiateur d’une surcharge pondérale sur le développement de la cardiotoxicité aux anthracyclines ; alors que la cardiotoxicité du trastuzumab ne semble pas être en revanche majorée par le surpoids. Nos travaux ont également permis de préciser les conditions dans lesquelles existent des potentialisations des effets lors de l’association doxorubicine et trastuzumab. / Cancer treatment has advanced considerably in recent years, allowing a reduction in mortality. Longer life expectancy of patients has helped to highlight the delayed onset of cardiovascular toxicity induced by these chemotherapies. The pathophysiological mechanisms responsible for these cardiac dysfunctions are complex, entangled and remain partially unknown. A better understanding of the phenomena involved in these cardiotoxicities is needed to prevent their occurrence. Therefore, we have developed two different experimental approaches to understand the pathophysiological mechanisms involved in the cardiac toxicity of anthracyclines and trastuzumab.A first experimental study aimed to clarify the role of iron in heart failure induced by anthracyclines. We have demonstrated that a tissular iron overload in mice prior to doxorubicin injection does not increase the cardiotoxicity of chemotherapy. On the contrary, the involvement of anti-radical defenses following the iron load could reduce cardiac oxidative damage generated by doxorubicin. In view of these data, the role of iron chelators in cardioprotection against anthracyclines has to be questioned.Our second experimental work was to elucidate the role of overweight in the development of anthracycline and trastuzumab cardiotoxicity. Using a mouse model of moderate overweight and of increased risk of cardiometabolic induced postnatal programming, we have highlighted the role of overweight on the development of anthracycline cardiotoxicity; whereas trastuzumab cardiotoxicity did not appear to be increased by overweight. Our work also clarified the conditions in which there are cumulative cardiac alterations when doxorubicin and trastuzumab are associated.

Le cancer est la première cause de décès au Canada et le cancer du sein est la forme la plus courante de cancer chez la femme. Le traitement privilégié lors d’un diagnostic de cancer du sein est l’utilisation de la doxorubicine, un agent de chimiothérapie de la famille des anthracyclines. Cet agent grandement utilisé en clinique permet de traiter différents types de cancer et possède un large spectre d’action. Cependant, son utilisation est limitée par l’apparition d’effets secondaires, lesquels peuvent se manifester longtemps après l’arrêt des traitements. L’un de ces effets particulièrement nocifs est le développement d’une cardiotoxicité, qui est dépendante de la dose et conduit à une insuffisance cardiaque congestive et irréversible. Les techniques utilisées en clinique pour déterminer le développement d’une cardiotoxicité reposent principalement sur l’évaluation de la fraction d’éjection du ventricule gauche (FEVG). Le projet comprend deux objectifs; 1) développer un modèle de cardiotoxicité, induite par l’administration de doxorubicine, chez la souris; 2) effectuer un suivi longitudinal par tomographie d’émission par positrons (TEP) afin de vérifier si certains paramètres métaboliques ou physiologiques permettraient de prédire le développement de la cardiotoxicité. Le suivi est effectué avec deux traceurs, le [indice supérieur 11]C-acétoacétate ([indice supérieur 11]C-AcAc), permettant d’évaluer à la fois la captation et la clairance du traceur par le coeur, mais semble avoir l’avantage de mettre en évidence l’insuffisance cardiaque sans avoir recours à un test à l’effort, comme le [indice supérieur 11]C-acétate. Le deuxième traceur est le [indice supérieur 18]F-FDG, couramment utilisé pour les examens cliniques, il permet de mesurer la consommation de glucose par le tissu cardiaque ainsi que la FEVG. Les deux traceurs ont été analysés à l’aide de modèles pharmacocinétiques afin de vérifier si les changements observés permettent de prédire hâtivement le développement de la cardiotoxicité, avant d’atteindre un état de non-retour. Les travaux réalisés ont permis de mettre au point un modèle de cardiotoxicité chez la souris suite à l’administration de chimiothérapie. Les résultats obtenus démontrent que des changements révélant le développement d’insuffisance cardiaque peuvent être observés hâtivement par une diminution de la captation myocardique et de la clairance du [indice supérieur 11]C-AcAc, indice de la perfusion et du métabolisme oxydatif myocardique, suivi d’une augmentation du taux de transfert du glucose vers le coeur qui arrive au même moment que la diminution de la FEVG.

L’objectif de ce projet de doctorat est de développer des outils quantitatifs pour le suivi des traitements de chimiothérapie pour le cancer du sein et de leurs effets cardiotoxiques à l’aide de l’imagerie TEP dynamique. L’analyse cinétique en TEP dynamique permet l’évaluation de paramètres biologiques in vivo. Cette analyse peut être utilisé pour caractériser la réponse tumorale à la chimiothérapie et les effets secondaires néfastes qui peuvent en résulter. Le premier article de cette thèse décrit la mise au point des techniques d’analyse cinétique qui utilisent la fonction d’entrée d’un radiotraceur dérivé de l’image dynamique. Des corrections de contamination radioactive externe (épanchement) et de l’effet de volume partiel ont été nécessaires pour standardiser l’analyse cinétique et la rendre quantitative. Le deuxième article porte sur l’évaluation d’un nouveau radiotraceur myocardique. Le [indice supérieur 11]C-acétoacétate, un nouveau radiotraceur basé sur un corps cétonique, a été comparé au [indice supérieur 11]C-acétate, couramment utilisé en imagerie cardiaque TEP. L’utilisation de [indice supérieur 3]H-acétate et [indice supérieur 14]C-acétoacétate ont permis d’élucider la cinétique de ces traceurs depuis la fonction d’entrée et la captation par les mitochondries cardiaques qui reflète la consommation en oxygène, jusqu’à la libération de leurs principaux métabolites réciproques ([indice supérieur 3]H[indice inférieur 2]O et [indice supérieur 14]CO[indice inférieur 2]). Le troisième et dernier article de cette thèse présente l’intégration d’un modèle qui évalue la réserve cardiaque de perfusion et de consommation en oxygène. Un modèle de cardiomyopathie a été établi à l’aide d’un agent chimiothérapeutique contre le cancer du sein, la doxorubicine, reconnu comme étant cardiotoxique. Un protocole de repos/effort a permis d’évaluer la capacité d’augmentation de perfusion et de consommation en oxygène par le coeur. La démonstration d’une réserve cardiaque réduite caractérise la cardiotoxicité. La dernière contribution de cette thèse porte sur la mise au point de méthodes peu invasives pour mesurer la fonction d’entrée en modèle animal avec l’utilisation de l’artère caudale et un compteur microvolumétrique, la bi-modalité TEP/IRM dynamique avec le Gd-DTPA et l’établissement d’un modèle d’évaluation simultané de cardiotoxicité et réponse tumorale chez la souris. Le développement d’outils d’analyse TEP dans l’évaluation de la cardiotoxicité lors de traitements du cancer du sein permet de mieux comprendre la relation entre les dommages mitochondriaux et la diminution de la fraction d’éjection.