Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un des cancers les plus létaux, tuant environ 95% des patients diagnostiqués à 5 ans. A l'heure actuelle, aucune chimiothérapie curative n'est disponible. La voie PI3K est une des voies les plus altérées dans les cancers. En particulier, dans la moitié des cancers pancréatiques, une augmentation d'activité de la voie PI3K/Akt/mTOR a été décrite et corrélée à un mauvais pronostic. Les enzymes de signalisation phosphoinositide-3-kinase (PI3K) de classe I sont présentes chez les mammifères sous plusieurs isoformes (p110a, p110ß p110d et p110y). Les isoformes p110a et p110ß sont ubiquitaires alors que p110d et p110y sont majoritairement exprimées dans les cellules immunitaires. Toutes les isoformes de classe I présentent un domaine d'activation par Ras, dont la fonctionnalité reste à être approfondie. Les PI3Ks de classe I phosphorylent le PIP2 en PIP3, un second messager lipidique capable de réguler des fonctions biologiques très variées telles que la prolifération ou la différenciation cellulaire. Bien que les rôles physiologiques des différentes isoformes de PI3K commencent à être connus, le débat actuel dans le domaine des PI3Ks est de savoir quelle isoforme cibler dans le traitement des cancers. Il a récemment été publié que la dépendance à la voie PI3K/Akt d'une tumeur est liée, selon l'organe et les altérations génétiques associées, à l'activité d'une isoforme. La mutation activatrice de l'oncogène KrasG12D est retrouvée dans plus de 90% des cas d'adénocarcinomes pancréatiques et est reconnue comme la mutation " initiatrice " du PDAC. Les souris qui présentent une activation constitutive de l'oncogène KrasG12D reproduisent toutes les étapes de la carcinogenèse pancréatique humaine, des lésions prénéoplasiques jusqu'à l'adénocarcinome (5% des souris à 12 mois). Partant des constats que les PI3K et Kras interagissent physiquement et que seules p110a et p110ß sont exprimées dans le pancréas sain, l'objectif de mon projet de thèse était de déterminer si les deux isoformes ubiquitaires de PI3K pouvaient jouer des rôles différents dans l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. Pour cela, nous avons généré un nouveau modèle murin qui associe la mutation de l'oncogène KrasG12D avec une inactivation conditionnelle de l'activité kinase de p110a ou de p110ß, mimant ainsi l'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique spécifique. Durant ma thèse, j'ai démontré que seule l'isoforme p110a est nécessaire à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. De manière dose-dépendante, l'inactivation d'une seule copie de p110a prolonge significativement la survie des animaux, tandis que les souris présentant une inactivation complète de l'activité kinase de p110a ne développent pas de lésion prénéoplasique. L'inactivation de cette seule isoforme bloque totalement la transdifférenciation des acini, normalement induite par Kras muté ou lors d'une pancréatite aigüe. p110a contrôle cette reprogrammation cellulaire, ainsi que les modifications morphologiques associées, en régulant les petites GTPases Rho, intermédiaires de signalisation essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. De plus, l'activité kinase de p110a est essentielle au maintien d'autres voies de signalisation oncogéniques comme les voies EGFR/MAPK, NF-kB ou encore IL6/STAT3. Dans un modèle de carcinogenèse pancréatique agressif où le suppresseur de tumeur p53 est partiellement inactivé, p110a exprimée dans l'épithélium est impliquée dans la progression tumorale en régulant la prolifération des cellules canalaires mais également, celle des cellules du microenvironnement par une action possiblement paracrine. Cette étude est la première démonstration génétique in vivo de l'implication d'une isoforme de PI3K dans le cancer du pancréas, et apporte un rationnel en faveur de l'utilisation des inhibiteurs spécifiques de p110a dans le traitement du cancer du pancréas. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal cancers, with a 5-yr survival rate <5% of diagnosed patients. No efficient chemotherapy is currently available. PI3K signaling is one of the most altered signaling pathways in cancer. In half of PDAC, PI3K/Akt/mTOR activation is increased and correlated with poor prognosis. Mammals have four isoforms of Class I PI3K (p110a, p110ß p110d and p110y)which activate the Akt/mTOR signaling pathway. p110a and p110ß are ubiquitously expressed whereas p110d and p110y are mainly expressed in immune cells. All PI3K isoforms possess a Ras-binding domain whether it is functional for all isoforms remains to be demonstrated. Upon cell stimulation by cell surface receptors, PI3K generate the phosphatidylinositol tri-phosphate (PIP3), a lipid messenger involved in many cellular processes such as cell growth, proliferation, migration or cell differentiation. PI3K isoforms have nonredundant roles under physiological, nondisease conditions. In cancer, this redundancy of PI3K isoforms appears more complex and intensely debated. It is thus crucial to delineate and understand which PI3K isoform we have to target for each cancer type. Recently, it was shown that PI3K/Akt tumour dependency is tissue-specific and depends on genetic alterations. KrasG12D -activating mutation is found in more than 90% of PDAC and known as the PDAC-initiative mutation. Pancreatic specific expression of a KrasG12D allele in mice faithfully reproduces human pancreatic cancerogenesis, from preneoplastic lesions to adenocarcinoma. Based on the fact that PI3K isoforms and Kras interacts physically and that Kras is the major mutation in PDAC, the aim of my PhD project aims to determine if the two ubiquitous PI3K isoforms, p110a and p110ß, could have non redundant roles during Kras-driven pancreatic cancer initiation. In order to dissect the putative divergent role of p110a and p110ß in the inititation of Kras-driven pancreatic cancerogenesis, we generated new mice models which combined the expression of mutated-Kras and an inactivation of the p110a or p110ß-kinase domains in the pancreas using a conditional targeting strategy, mimicking pharmacological blockade of p110a or p110ß activity. During my PhD, I demonstrated that PI3K p110a isoform is required for Kras-driven pancreatic cancerogenesis. Inactivation of one copy of the pik3ca gene is sufficient to prevent mouse lethality and complete inactivation of p110a catalytic activity completely blocked the occurrence of all types of preneoplastic lesions induced by mutated Kras. Inactivation of this single isoform abrogates the transition of exocrine acinar cells into pancreatic preneoplastic ductal lesions induced by oncogenic Kras and/or pancreatic injury. p110a signaling through small GTPase Rho and actin cytoskeleton controls the reprogramming of acinar cells and regulates cell morphology in vivo and in vitro. Moreover, p110a kinase activity is required for the maintenance of other oncogenic signaling pathways as EGFR/MAPK, NF-kB or IL6/STAT3 axis. Finally, epithelial p110a was necessary for pancreatic ductal cancers to arise from Kras-induced pancreatic preneoplastic lesions by increasing epithelial and stromal cells proliferation in the context of mutated p53. This is the first genetic demonstration of the physiopathological implication of one PI3K isoform in PDAC in vivo and my data provide a strong rational for the use of selective p110a inhibitors in pancreatic cancer therapeutic strategy.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La protéine O-fucosyltransférase 1 (POFUT1) réticulaire, dont le gène est localisé dans la région chromosomique 20q11.21 chez l’Homme, catalyse le transfert d’un fucose qui sera O-lié sur la sérine ou la thréonine présente dans la séquence consensus (C2X4S/TC3), portée par un domaine EGF-like d’une glycoprotéine membranaire ou sécrétée. Le knockdown de Pofut1 (Po -) dans la lignée myoblastique murines C2C12 conduit à la formation de myotubes allongés et minces, à faible nombre de noyaux ainsi qu’à une sous-expression du marqueur myogénique tardif Myf6, suggérant des défauts significatifs dans la fusion secondaire. La signalisation NFATc2/IL-4 est décrite comme la voie principale associée à cette étape. Nous montrons que la moindre expression de Nfatc2 dans les myotubes Po - est corrélée à une baisse de l'IL-4 sécrétée et à une faible quantité de son récepteur (IL-4Rα) présent chez les cellules de réserve qui doivent participer à la fusion avec les myotubes naissants. La neutralisation de l’IL-4Rα sur les C2C12 sauvages provoque des défauts d'accrétion myonucléaire, semblables à ceux observés pour les Po -. Ainsi, POFUT1 pourrait être un nouveau médiateur de la croissance des myotubes au cours du processus myogénique, notamment par la signalisation NFATc2/IL-4. La glycoprotéine WIF1, cible potentielle de POFUT1, est un antagoniste de la signalisation WNT via sa fixation aux protéines WNT. Cette voie est connue pour être impliquée dans la prolifération et la différenciation des myoblastes. Néanmoins, aucune donnée ne concerne le rôle de WIF1 dans le processus myogénique. Par un apport exogène de WIF1, nous avons montré l’augmentation de la prolifération et l’altération de la différenciation myoblastique des C2C12. Lors de la prolifération, une augmentation de l’expression de Myf5 et une diminution de MyoG sont observées. A 7 jours de différenciation, les myotubes Po - ont un diamètre plus petit que les myotubes sauvages et ils sont plus nombreux à avoir un faible nombre de noyaux, traduisant des défauts de fusion. Nous démontrons pour la première fois, l’implication de la protéine WIF1 dans le processus myogénique. Récemment, POFUT1 a aussi été proposé comme nouveau biomarqueur pour certains cancers, mais pas évalué dans le cancer colorectal (CCR). Nous avons donc collecté des données issues de 626 tumeurs et 51 tissus adjacents non tumoraux disponibles dans FireBrowse, celles de lignées cellulaires cancéreuses colorectales et de prélèvements tumoraux provenant du Centre de Ressources Biologiques du CHU de Limoges. Une surexpression de POFUT1 est observée dès le stade I, majoritairement due à une amplification de la région 20q11.21. Elle est significativement associée aux adénocarcinomes non mucineux et à une localisation rectale. De plus, l’expression de POFUT1 est corrélée à celles des récepteurs NOTCH ainsi qu’au processus métastatique, probablement par activation de la voie NOTCH. A ce titre, POFUT1 pourrait être considéré comme un nouveau biomarqueur pour le diagnostic du CCR. / The ER protein O-fucosyltransferase 1 (POFUT1), whose gene is located at the 20q11.21 chromosomic region in humans, catalyzes O-linked fucose addition to serine or threonine present in the consensus sequence (C2X4S/TC3) carried by EGF-like domain of membrane or secreted glycoprotein. Pofut1 knockdown (Po -) in murine myoblast C2C12 cell line leads to formation of elongated and thin myotubes, with a low number of nuclei and to downexpression of the late myogenic marker Myf6, suggesting significant defects in secondary fusion. NFATc2/IL-4 signaling is described as the main pathway associated to this step. We showed that the slightest expression of Nfatc2 in Po - myotubes is correlated with a decrease in IL-4 secretion and a lower quantity of IL 4Rα in reserve cells, which had to fuse with nascent myotubes. IL-4Rα neutralization on wild-type C2C12 causes myonuclear accretion defects, similar to those observed in Po -. Then, POFUT1 could be a new mediator of myotube growth during myogenic process, particularly through NFATc2/IL-4 signaling. The glycoprotein WIF1, potential POFUT1 target, is an antagonist of WNT signaling via its binding to WNT proteins. This pathway is involved in proliferation and differentiation of myoblasts. However, no data are available on WIF1 role in the myogenic process. Through exogenous WIF1 treatment, we showed a proliferation increase and a myoblast differentiation impairment in C2C12. During proliferation, increase in Myf5 and decrease in MyoG expressions are observed. At 7 days of differentiation, Po - myotubes have a smaller diameter than wild-type ones and are more numerous to have a small number of nuclei, reflecting fusion defects. For the first time, we demonstrate the involvement of WIF1 in the myogenic process. Recently, POFUT1 was proposed to be a new biomarker for several cancers, but not evaluated in colorectal cancer (CRC). We used data from 626 tumors and 51 adjacent non-tumor tissues available at FireBrowse, colorectal cancer cell lines and tumor samples from the Biological Resource Centre of Limoges hospital. A POFUT1 overexpression is observed from stage I, mainly due to amplification of 20q11.21 region. It is significantly associated to non-mucinous adenocarcinoma and to rectum location. Moreover, POFUT1 expression is correlated with those of NOTCH receptors as well as the metastatic process, probably by activation of the NOTCH pathway. POFUT1 could therefore be considered as a new biomarker for CRC diagnosis.

Durant le développement myocardique, les cardiomyocytes s'allongent et se connectent entre eux grâce à une structure spécialisée, le disque intercalaire. Cette organisation des cardiomyocytes est essentielle pour le couplage mécanique et la conduction électrique. Un des éléments responsables de l'insuffisance cardiaque est la perturbation de ces sites de contact intercellulaire. Actuellement, aucun facteur n'est connu pour coordonner l'organisation polarisée des cardiomyocytes. Ici, nous présentons une augmentation importante de Pdzrn3 dans des cardiomyopathies hypertrophiques humaines et dans des myocardes murins, corrélée à une perte de l'élongation polarisée des cardiomyocytes. De plus la délétion spécifique intramyocardique de l'expression de Pdzrn3, dans un modèle murin, protège de la survenue d'une insuffisance cardiaque secondaire à une cardiomyopathie hypertrophique. Nos résultats révèlent une nouvelle voie de signalisation qui contrôle un programme génétique essentiel pour le développement myocardique, le maintien de la géométrie et de la fonction contractile des cardiomyocytes. Cette voie de signalisation implique PDZRN3 et cette molécule constitue une cible thérapeutique potentielle pour la protection de l’insuffisance cardiaque chez l’homme. / During heart maturation, individual cardiomyocytes stretch out and connect some with the others via their extremities by intercalated disk protein complexes. This planar and directionnel organization of the myocyte sis crucial for the machanical coupling and the anisotropic conduction of the electric signal in the heart. One of the hallmarks of heart failure concerns alterations in the contact sites between cardiomyocytes. Yet no factors on its own is known to coordinate cardiomyocyte polarized organization. Here we reported enhanced levels of Pdzrn3 in the diseased hypertrophic human and mouse myocardium, correlated with the loss of cardiomyocyte polarized elongation. Furthermore, mouse cardiac Pdzrn3 deficiency protected against heart failure in a mouse model of hypertrophic cardiomyopathy. Our results reveal a novel signaling that controls a genetic program essential for heart maturation and for maintain of cardiomyocyte overall geometry and contractile function and implicates PDZRN3 as a potential therapeutic target for human heart failure protection.

La protéine GPR50, qui fait partie de la famille des récepteurs de la mélatonine, est classée, avec une centaine d’autres protéines à sept domaines transmembranaires (7TM), dans la catégorie des récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPG) orphelins, c’est-à-dire pour lesquels aucun ligand n’a pu être identifié. De plus en plus d’études montrent que les 7TM peuvent avoir des fonctions indépendantes d’un ligand. C’est le cas de GPR50 qui inhibe les fonctions du récepteur de la mélatonine MT1 en interagissant directement avec lui. Nous avons cherché à identifier d’autres partenaires associés à GPR50 en appliquant la technique de purification par affinité en tandem et avons mis en évidence son interaction avec un récepteur du facteur de croissance Transforming Growth Factor ß (TGFβ), le récepteur de type I (TβRI).Nous décrivons ici la formation d’un complexe entre GPR50 et le récepteur TβRI au niveau de la membrane plasmique, avec pour conséquence l’induction d’une activité constitutive du récepteur et des voies de signalisation en aval en l’absence de TGFβ, mais également en l’absence du récepteur TßRII qui est habituellement indispensable pour l’activation de TβRI par phosphorylation. Cette activité constitutive se traduit par la phosphorylation des protéines Smad2 et Smad3, leur intégration dans un complexe avec Smad4, la translocation du complexe dans le noyau et finalement l’activation de la transcription de leurs gènes-cibles. Nous avons décrypté les mécanismes moléculaires de cette activation constitutive en montrant que GPR50 entre en compétition, pour l’interaction avec TβRI, avec le régulateur négatif FKBP12, une protéine inhibitrice de l’activité basale du récepteur en l’absence de ligand. Nous avons identifié dans la queue intracytoplasmique de GPR50 un motif répétitif similaire à la séquence de FKBP12 impliquée dans son interaction avec TβRI , motif qui constitue la base moléculaire de cette compétition.Nous avons étudié les conséquences fonctionnelles de cette activation en surexprimant GPR50 de manière stable dans la lignée cellulaire MDA-MB-231, dérivée d’un cancer de sein. Nous avons observé dans ces cellules des effets pro-migratoires et anti-prolifératifs similaires à ceux causés par l’administration de TGFβ.En conclusion, ce travail décrit un nouveau mode d’activation du récepteur TβRI en l’absence de ligand, mais identifie également une nouvelle fonction indépendante d’un ligand pour le RCPG orphelin GPR50. En perspective de ce travail, nous allons essayer d’identifier des conditions biologiques où cette interaction pourrait prendre place afin de confirmer ces résultats dans un contexte plus physiologique. / During the last years, it became more and more accepted, that orphan G Protein coupled receptors (GPCRs) with a transmembrane spanning heptahelical core (7TM) can have ligand-independent functions. One of those 100 orphan GPCRs is GPR50, a 7TM protein with a long cytosolic domain. Recently, studies revealed ligand-independent functions for GPR50, where it has the capacity to modulate the activity of other proteins upon complex formation. By applying a tandem affinity purification approach we sought to identify further putative interacting partners of GPR50. One of the identified binding partners is the transforming growth factor β (TGFβ) receptor type I (TβRI).The TGFβ-dependent signal transduction pathway of serine/threonine kinases is a pathway with direct signal flow from ligand over the receptor to its substrates, the Smads which translocate into nucleus where they bind DNA and regulate gene expression. An important question concerns the generation of specificity and fine-tuning of TGFβ-dependent signaling. Throughout the years, an important number of proteins which regulate the activity of the TGFβ signal transduction pathway in a positive or negative manner have been identified. Most of them act in a cell-context-dependent manner, allowing the regulation of TGFβ signaling adapted to the particular circumstances.We report here the complex formation of GPR50 and TβRI on the plasma membrane. The consequence of this interaction is the GPR50-mediated induction of a constitutive activation of the TβRI and its downstream signaling in a TGFβ ligand-independent manner. This has been monitored by Smad2/3 phosphorylation, Smad2/3-Smad4 complex formation and their subsequent translocation into the nucleus, where they activate Smad-dependent gene expression. In order to decipher the molecular mechanism that allows this activation, we showed that GPR50 competes with the negative regulator, that prevents leaky TGFβ signaling, the gatekeeping molecule FKBP12, for binding to the TβRI. We identified a motif in FKBP12 involved in the interaction with TβRI with similarities to a motif in GPR50, providing a molecular basis for the replacement of FKBP12 by GPR50 in the TβRI complex. We showed that GPR50 is capable of activating the TβRI even in the absence of the TβRII, which normally is required for activating the TβRI by phosphorylation. This reveals a previously unknown mode of activation of the TβRI in absence of the TGFβ ligand and TβRII. In order to identify the functional consequences of this crosstalk, we studied migration and growth of MDA-MB-231 breast cancer cells stably overexpressing GPR50. In these cells, TGFβ-like pro-migratory and anti-proliferative effects have been observed.Future research will help to identify tissues and biological circumstances, where this crosstalk could take place for putting this novel mode of regulation of TGFβ signaling pathway into a context-dependent-manner. Additionally our work established another ligand-independent task for the orphan 7TM protein GPR50, consolidating its function as binding partner and activity modulator.

Le Syndrome de l'Intestin Irritable (SII) est caractérisé par des douleurs abdominales chroniques, des diarrhées, des constipations ou l'alternance des deux. Les neurones sensitifs des patients seraient surexcitables et ainsi à l'origine de l'hypersensibilité viscérale ressentie. Parmi les médiateurs impliqués dans le SII, les protéases ont un rôle prépondérant notamment car il a été observé une augmentation de leur activité dans des surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII. Ces protéases sont capables d'activer les " Protease-Activated Receptors " (PARs) dans les neurones sensitifs de souris. L'activation des neurones sensitifs murins peut être déclenchée selon un mécanisme dépendant de PAR2 et générant une hypersensibilité viscérale, mais inhibée par un mécanisme dépendant de PAR4. Dans certaines cellules (plaquettes), les PARs ont des rôles très différents entre la souris et l'homme. L'expression et la signalisation des PARs dans les neurones sensitifs humains étant jusqu'alors inconnues, cette thèse a eu pour objectif général d'étudier la signalisation des PARs et d'identifier les effets de médiateurs présents dans les tissus de patients atteints du SII, sur leur capacité à activer des neurones sensitifs humains. Le but ultime était d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII chez l'homme. Le premier objectif a été de mettre au point la culture de neurones humains des ganglions spinaux dorsaux (GSD) thoraciques, contenant des projections coliques de neurones sensitifs. Une culture de neurones sensitifs d'une pureté de 90% a été obtenue, ces neurones étaient viables et fonctionnels, mobilisant du calcium intracellulaire en réponse à différents agonistes pro-nociceptifs. L'expression des PARs a été étudiée dans ces cultures et comparée à celle dans des tissus de GSD frais. PAR1, PAR2 et PAR4 de même que d'autres récepteurs canaux de la famille des " Transcient Receptors Potential " (TRPs) étaient exprimés de façon comparable dans les GSD fraichement isolés et dans les cultures de neurones, validant ainsi le phénotype physiologique des neurones en culture. L'effet des agonistes des PARs a ensuite été étudié sur la signalisation calcique dans ces cultures de neurones sensitifs humains. De tous les agonistes peptidiques des PARs utilisés, seul le peptide activateur de PAR1 a conduit à une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains, tandis que le peptide agoniste de PAR4 l'a réduite. Comme le peptide activateur de PAR1, la thrombine, une protéase capable d'activer à la fois PAR1 et PAR4 a induit une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains. La mobilisation calcique induite par la thrombine a été inhibée par un antagoniste de PAR1 et potentialisée par un antagoniste de PAR4. La thrombine exerce donc un double effet contradictoire sur les neurones sensitifs humains, induisant un signal calcique par l'activation de PAR1 et l'inhibant par l'activation de PAR4. Les surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII mais pas ceux de contrôles sains, ont provoqué un flux calcique dans les neurones sensitifs humains par un mécanisme dépendant de l'activation de PAR1. Nos résultats mettent en évidence l'importance de réduire la sensibilisation des neurones sensitifs humains dépendante de l'activation de PAR1 dans le SII. Notre technique de culture de GSD humains offre de nouvelles applications en neurosciences et nos résultats permettent d'envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques quant à l'utilisation d'un antagoniste de PAR1 pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII. / Irritable Bowel Syndrome (IBS) is characterized by chronic abdominal pain, diarrhea and/or constipation. Sensory neurons from IBS patients are considered to be over-activated, being thereby responsible of the experienced visceral pain. Among mediators involved in IBS, proteases seem to have a prominent role. First, proteolytic activity is increased in the supernatants of colonic biopsies from IBS patients. Second, these proteases activate " Proteases-Activated Receptors " (PARs) in rodent sensory neurons. Rodent primary afferent activation can be induced by a PAR2-dependent mechanism, which generates visceral hypersensitivity. This mechanism can be inhibited by a PAR4-dependent mechanism. In some cell types such as platelets, PARs may have very different functions in rodent versus human. The expression and the signalization of PARs in human sensory neurons have never been explored. The general aim of this thesis was to study the signalization of PARs and to identify the effect of mediators present in tissues from IBS patients, on their ability to activate human sensory neurons. The final objective was to identify new possible therapeutic targets to treat visceral pain associated with IBS. The first objective was to establish a protocol for culturing human sensory neurons isolated from thoracic dorsal root ganglia (DRG). Thoracic DRG contain the stroma of sensory neurons projecting from the colon. The culture of human sensory neurons was 90% pure with viable and functional neurons, which were able to induce calcium flux in response to different pro-nociceptive agonists. PAR expression was studied in cultures and compared to fresh DRG tissues. PAR1, PAR2 and PAR4 as well as others receptors from the " Transcient Receptors Potential " (TRPs) channel family were similarly expressed in neurons from fresh DRG tissues and in cultured sensory neurons, thereby validating the physiological phenotype of human DRG neurons in culture. The effect of PAR agonists was studied by imaging calcium mobilization in human sensory neuron cultures. From all PAR agonist peptides used, only PAR1 agonist peptide was able to increase calcium signaling in human sensory neurons, while PAR4 agonist peptide was able to decrease this calcium signaling. Similar to PAR1 agonist peptide, thrombin a protease capable of activating both PAR1 and PAR4, induced an increase of calcium flux in human sensory neurons. Thrombin-induced calcium mobilization was inhibited by a PAR1 antagonist and was potentiated by a PAR4 antagonist. Thus, thrombin has a contradictory double effect on human sensory neurons, inducing calcium signaling through PAR1 activation and inhibiting calcium signaling through PAR4 activation. In addition, supernatants of colonic biopsies from IBS patients but not from healthy controls, provoked an increased calcium signaling in human sensory neurons. This effect was dependent on the activation of PAR1. In the context of IBS, our results highlight the importance of targeting PAR1-induced sensitization in human sensory neurons. The DRG culture technique we have established offers important and new applications in the domain of neurosciences. All together, these data point to new therapeutic possibilities for the use of PAR1 antagonist in the treatment of visceral pain associated with IBS.

La dérégulation de la transcription résultant de mutations des molécules clés des voies de signalisation est une caractéristique des cancers. Dans les mélanomes, les facteurs de transcription MITF et BRN-2 contrôlent la survie, la prolifération, la différenciation et la migration/invasion cellulaire, avec une forte expression de MITF caractérisant les cellules les plus différenciées. BRN-2 est surexprimé dans les cellules de mélanomes où il peut réprimer l’expression de MITF conduisant ainsi les cellules vers un phénotype moins différencié et plus invasif. Comment BRN-2 est régulé est une question majeure. Nous avons montré que l’expression de BRN-2 est modulée en réponse aux variations des concentrations en oxygène et glucose et que cet effet est en partie médié par la PI3K. L’inhibition de la voie PI3K réduit l’invasion des cellules de mélanome et diminue l’expression des protéines BRN-2 et PAX3. PAX3 régule l’expression de BRN-2 par liaison directe sur son promoteur. Ces résultats suggèrent, qu’en plus des voies β-caténine/LEF1 et BRAF/MAPK, la voie PI3K régule l’expression de BRN-2 et pourrait jouer un rôle majeur dans le changement du phénotype prolifératif à invasif / Deregulation of transcription arising from mutations in key signaling molecules is a hallmark of cancer. In melanoma, MITF and BRN-2 transcription factors control survival, proliferation, differentiation and migration/ invasiveness, with high levels of MITF being a characteristic of differentiated melanocytes. BRN-2 represses MITF expression, thereby driving cells to a less differentiated and more invasive phenotype. How BRN-2 is regulated is therefore a key issue. We showed that up-regulation of BRN-2 expression in response to glucose involves the PI3K pathway. Inhibition of PI3K reduces invasiveness and decreases the levels of BRN-2 and PAX3. We showed that PAX3 regulates BRN-2 expression by direct binding on its promoter. Altogether, our results highlight a crucial role for the PI3K pathway in regulating BRN-2 expression and imply that PI3K signaling may be a key determinant of melanoma subpopulation diversity and prime cells for a proliferative to invasive phenotype switch.

La doxorubicine (DXR) est l’un des médicaments les plus efficaces en chimiothérapie, mais sonapplication clinique est limitée par ses effets cardiotoxiques. Malgré des décennies de recherche, sesmécanismes pathogéniques ne sont toujours pas entièrement compris. Il s’ensuit qu’aucun traitementsatisfaisant, curatif ou préventif, n’existe. Dans cette étude, nous recherchons les mécanismes designalisation cellulaire impliqués. Deux modèles expérimentaux de toxicités, aigue d’une part (coeurisolé et perfusé de rat avec la DXR), et chronique d’autre part (rat traité à la DXR), ont permis deréaliser une étude ciblée (sur les voies de signalisation énergétiques) et deux études systémiques(phosphoprotéomique et transcriptomique). Les résultats combinés de ces travaux ont montré que laDXR modifiait le niveau de phosphorylation (activation) ou l’expression génique de protéinesimpliquées dans trois domaines fonctionnels distincts : métabolisme énergétique, réponses au stress,et structure/fonction du sarcomère. (i) Métabolisme énergétique : nous avons confirmé la surprenanteinhibition de l’AMPK, probablement provoquée par un contrôle négatif exercé par des partenaires designalisation (Akt et ERK), plutôt que par une modification des kinases activatrices en amont. Nousavons également montré l’augmentation du niveau de phosphorylation de la PDH, ce qui, en inhibantl’enzyme, ralentit le cycle de Krebs. Cependant, nous avons également observé un phénomènecompensatoire de surexpression de gènes codant pour des enzymes de la glycolyse et du cycle deKrebs ; (ii) Réponses au stress : dans nos modèles, la DXR génère des stress énergétique,génotoxique et oxydatif. Cependant, seuls quelques mécanismes compensatoires sont activés (lesvoies de signalisation de DNA-PK–Akt–GSK3, diverses chaperonnes). Les autres semblent êtreinhibées suggérant que l’amoindricement des réponses au stress serait un des mécanismes de lacardiotoxicité de la DXR; (iii) Structure/fonction du sarcomère: L’augmentation de la phosphorylationde la desmine ainsi que la réduction du nombre de transcrits codant pour des protéines essentiellesau développement cardiaque normal pourraient être la cause de la désorganisation du réseaumyofibrillaire. En conclusion, ces résultats révèlent potentiellement de nouveaux mécanismes de lacardiotoxicité induite par la DXR et permettent d’envisager de nouvelles cibles moléculaires pour ledéveloppement de stratégies protectrices. / Doxorubicin (DXR) is an efficient anticancer drug, the use of which is limited by seriouscardiotoxicity. Despite decades of research, its pathogenic mechanisms are not fully understood, andefficient preventive or curative strategies are not available. Here we address the question whethermechanisms in cardiac cell signaling contribute to the toxicity phenotype. Using experimental modelsfor acute (DXR-perfused, isolated rat hearts) or chronic toxicity (rats injected with DXR), we conducteda targeted study (focusing on energy signaling pathways) and two non-biased studies(phosphoproteomics and transcriptomics). The combined data reveal DXR-induced alterations inphosphorylation (activation) status or gene expression of proteins in mainly three functional domains:energy metabolism, stress responses, and sarcomere structure. (i) Energy metabolism: We confirm aparadox inhibition of AMPK signaling, that is rather due to inhibitory cross-talk with related signalingpartners (Akt, ERK) than impaired AMPK upstream signaling. We also show, among others, theincrease of inhibitory phosphorylation of pyruvate dehydrogenase, slowing down Krebs cycle, but alsoa compensating upregulation of glycolysis and Krebs cycle enzyme transcripts. (ii) Stress-responses:In our models, DXR generates energetic, oxidative and genotoxic stress, but only some compensatorystress responses are activated (DNA-PK–Akt–GSK3 pathway, chaperones). Many others seem to beinhibited, suggesting a blunted response to stress as component of DXR toxicity. (iii) Sarcomerestructure/function: We detect increased phosphorylation of desmin and reduced transcripts essentialfor e.g. normal heart development as potential causes for a disorganized myofibrillar network. Inconclusion, these results reveal some novel potential mechanisms of DXR-induced cardiotoxicity andsuggest new targets for protective strategies.

La doxorubicine (DXR) est l'un des médicaments les plus efficaces en chimiothérapie, mais sonapplication clinique est limitée par ses effets cardiotoxiques. Malgré des décennies de recherche, sesmécanismes pathogéniques ne sont toujours pas entièrement compris. Il s'ensuit qu'aucun traitementsatisfaisant, curatif ou préventif, n'existe. Dans cette étude, nous recherchons les mécanismes designalisation cellulaire impliqués. Deux modèles expérimentaux de toxicités, aigue d'une part (coeurisolé et perfusé de rat avec la DXR), et chronique d'autre part (rat traité à la DXR), ont permis deréaliser une étude ciblée (sur les voies de signalisation énergétiques) et deux études systémiques(phosphoprotéomique et transcriptomique). Les résultats combinés de ces travaux ont montré que laDXR modifiait le niveau de phosphorylation (activation) ou l'expression génique de protéinesimpliquées dans trois domaines fonctionnels distincts : métabolisme énergétique, réponses au stress,et structure/fonction du sarcomère. (i) Métabolisme énergétique : nous avons confirmé la surprenanteinhibition de l'AMPK, probablement provoquée par un contrôle négatif exercé par des partenaires designalisation (Akt et ERK), plutôt que par une modification des kinases activatrices en amont. Nousavons également montré l'augmentation du niveau de phosphorylation de la PDH, ce qui, en inhibantl'enzyme, ralentit le cycle de Krebs. Cependant, nous avons également observé un phénomènecompensatoire de surexpression de gènes codant pour des enzymes de la glycolyse et du cycle deKrebs ; (ii) Réponses au stress : dans nos modèles, la DXR génère des stress énergétique,génotoxique et oxydatif. Cependant, seuls quelques mécanismes compensatoires sont activés (lesvoies de signalisation de DNA-PK-Akt-GSK3, diverses chaperonnes). Les autres semblent êtreinhibées suggérant que l'amoindricement des réponses au stress serait un des mécanismes de lacardiotoxicité de la DXR; (iii) Structure/fonction du sarcomère: L'augmentation de la phosphorylationde la desmine ainsi que la réduction du nombre de transcrits codant pour des protéines essentiellesau développement cardiaque normal pourraient être la cause de la désorganisation du réseaumyofibrillaire. En conclusion, ces résultats révèlent potentiellement de nouveaux mécanismes de lacardiotoxicité induite par la DXR et permettent d'envisager de nouvelles cibles moléculaires pour ledéveloppement de stratégies protectrices.