Les hydrogénases FeFe sont des métalloenzymes qui catalysent l'oxydation et la production de H$_2$. Le cycle catalytique et de nombreux aspects de la réactivité de ces enzymes, y compris l'inactivation aérobie et anaérobie, ne sont toujours pas complètement compris. J'ai développé une nouvelle technique appelée photo-électrochimie directe et je l'ai utilisée pour étudier l'effet de l'irradiation sur la cinétique d'inhibition par le CO de trois hydrogénases FeFe distinctes. J'ai déterminé le spectre d'action de la photo-dissociation de l'inhibiteur CO et j'ai décrit le processus au niveau QM pour la première fois, en obtenant un bon accord entre les expériences et la théorie.J'ai également étudié la photoinhibition de l'enzyme. J'ai effectué des expériences de photoélectrochimiques en irradiant la protéine avec des diodes laser monochromatiques dans le domaine de la lumière visible, une lampe halogène ou une lampe au xénon et j'ai observé que les hydrogénases FeFe de C. reinhardtii et C. acetobutylicum sont irréversiblement inactivées par la lumière UVB. En utilisant la DFT et la TDDFT, j'ai conclu que les étapes initiales de la photoinhibition consistent en la photodissociation d'un ligand carbonyle intrinsèque du site actif, suivie de la formation d'une espèce inactive stable.J'ai aussi effectué des expériences préliminaires pour examiner l'effet de la lumière sur l'activité de deux autres métalloenzymes: la CO déshydrogénase et la hydrogénase NiFe.Mes résultats illustrent la force de l'approche méthodologique qui combine électrochimie directe et TDDFT, et apportent de nouvelles connaissances sur les propriétés chimiques et photochimiques de plusieurs métalloenzymes. / FeFe hydrogenases are metalloenzymes that catalyze the oxidation and production of H$_2$. The catalytic cycle and many aspects of the reactivity of these enzymes, including their aerobic and anaerobic inactivation, are still the subjects of intense investigations. I developed a new technique called direct photo-electrochemistry and I used it to study the effect of monochromatic irradiation in the visible range on the kinetics of inhibition by CO of three distinct FeFe hydrogenases. I determined the action spectrum of the photo-dissociation of the inhibitor CO and I described the process at the QM level for the first time, obtaining good agreement between experiments and theory.I also studied the photoinhibition of the enzyme. I carried out photoelectrochemistry experiments irradiating the protein with monochromatic visible light laser diodes, a halogen lamp or a xenon lamp, and I observed that the FeFe hydrogenases from C. reinhardtii and C. acetobutylicum are irreversibly inactivated by UVB light. Using DFT and TDDFT, I concluded that the initial steps of photoinhibition consist in the photodissociation of one carbonyl intrinsic ligand of the active site, followed by the formation of a stable inactive species.I also performed preliminary experiments to examine the effect of light on the activity of two other metalloenzymes: Carbon monoxide dehydrogenase (CODH) and NiFe-hydrogenase.My results illustrate the strength of the methodological approach that combines direct electrochemistry and TDDFT, and reveal new insights in the chemical and photochemical properties of several metalloenzymes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017AIXM0290 |
| Date | 08 November 2017 |
| Creators | Sensi, Matteo |
| Contributors | Aix-Marseille, Università degli studi di Milano - Bicocca. Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Léger, Christophe, De Gioia, Luca |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
Page generated in 0.002 seconds