Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La possibilité de reproduire une activité enzymatique de manière artificielle est l’un des objectifs de la chimie moderne mais reste un grand défi, même dans le cas de l’activation de petites molécules. Dans le cas du dihydrogène, certaines bactéries s’en servent comme vecteur d’énergie par l’intermédiaire d’enzymes appelées hydrogénases qui peuvent former ou consommer le dihydrogène grâce à des complexes à base de métaux non nobles. Le dihydrogène pouvant être également utilisé comme vecteur d’énergie dans nos sociétés, les hydrogénases font l’objet de nombreuses recherches. Jusqu’à présent, la plupart des complexes modèles d’hydrogénases se sont employés à modifier la première sphère de coordination pour reproduire au mieux ses propriétés électroniques. Néanmoins, l’étude de mutations ciblées des hydrogénases indique que plusieurs résidus d’acides aminés présents dans le site actif sont indispensables à la stabilité du complexe et à son efficacité catalytique, montrant ainsi comment le mime d’une deuxième sphère de coordination pourrait améliorer les propriétés des catalyseurs artificiels. Notre approche a consisté en l’utilisation de foldamères de type oligoamide aromatique, formant un cône autour d’un complexe modèle d’hydrogénase. La synthèse convergente du composé final, son étude structurale à l’état solide (diffraction des rayons X), en solution (RMN, IR) ainsi que sa dynamique ont été étudiées. La modification de la première sphère de coordination du complexe modèle en présence du foldamère est également décrite et montrant notamment leur interaction. / The ability to replicate enzymatic activity with a synthetic molecule is a highly sought after goal in modern chemistry. However, it remains a big challenge even in case of activation of small molecules. In the case of hydrogen, some bacteria can use it as energy carrier by means of enzymes called hydrogenases that can reversely make or break the bond of hydrogen molecules and are made of earth abundant metals. As hydrogen could be used for the same purpose of energy storage in our society, hydrogenases caught interest of scientific community. To date, most biomimetic hydrogenase models mainly focus on first coordination sphere modifications to fine-tune structure and physical properties. However, point mutation studies indicate that several of the amino acid residues surrounding the enzyme active site are required for structural stability or high turnover frequencies. It shows how mimicking second coordination sphere could improve the capabilities of synthetic catalysts. Our approach used aromatic oligoamide foldamers as helical scaffolds around an inspired 2Fe2S4cluster. Convergent synthesis of the final molecule and structural studies in the solid state (x-ray) and in solution (NMR, IR) as well as the dynamic behaviour are reported. Modifications of the first coordination sphere of the model complex in presence of the foldamer are also described, showing interactions between them.

Le développement d’une économie basée sur l’hydrogène implique l’utilisation de catalyseurs efficaces et peu chers. Pour cela on peut s’inspirer de la nature qui a produit des métalloenzymes, les hydrogénases. On considère que la maturation est réalisée en deux étapes. Dans un premier temps, les clusters [4Fe–4S] sont assemblés par les systèmes ISC/SUF. Puis trois maturases, HydE/F/G réalisent la biosynthèse du 2Fe sous-cluster pour synthétiser le cluster-H. Seules quelques hydrogénases à [FeFe] ont été caractérisées montrant une grande diversité alors qu’elles possèdent le même centre catalytique, le cluster-H. Ainsi, une partie de cette thèse a porté sur l’utilisation de la «maturation chimique» pour activer de nouvelles enzymes apo-HydA. L’hydrogénase provenant de Megasphaera elsdenii, et sa version tronquée, MeH-HydA, contenant seulement le domaine du cluster-H ont été étudiées grâce à cette technique. La stratégie mise en œuvre a été la reconstitution des cofacteurs métalliques par l’assemblage des clusters [4Fe–4S] et la maturation des enzymes par le complexe biomimétique [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–. Les hybrides HydF synthétisés en incubant la protéine contenant le cluster [4Fe–4S] avec les complexes biomimétiques [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– possèdent un centre à 6 fers similaire au cluster-H. Cette grande similarité amène au dernier point traité dans cette thèse: la possible activité catalytique d’HydF en tant que «hydrogénase artificielle». Les hybrides de HydF ont été caractérisés et leur activité d’hydrogénase a été évaluée. De plus, une structure RX de la protéine contenant son cluster [4Fe-4S] a été obtenue. / There is a general agreement that the building of a sustainable H2 economy relies on the availability of cheap, abundant and efficient catalysts. Nature has provided attractive solutions, hydrogenases. However, these enzymes are difficult to produce and so far only few HydAs have been completely characterized showing diversity despite the same active site. This core, H-cluster, is composed of a [4Fe–4S] cluster bound via a Cys to a diiron complex which has 3 CO, 2 CN and an azadithiolate ligands. Recently, it has been showed that hydrogenases can be easily produced through the insertion of a biomimetic [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2– complex inside the heterologously produced apo-enzyme, resulting in a full activation. Part of the PhD has been focused on the chemical maturation of new HydA from Megasphaera elsdenii and its truncated version, MeH-HydA, containing only the H-cluster. The assembly of all metal cofactors via the chemical reconstitution of the [Fe–S] clusters and the maturation through the [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–complex has been carried out. Interestingly, HydF hybrids synthesized incorporating biomimetic [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– complexes onto the [4Fe–4S] cluster HydF protein, have a 6Fe core reminiscent of the H-cluster. HydFs from different organisms were purified and subsequently the [4Fe–4S] cluster has been reconstituted. For the first time, an X-ray structure of HydF with its [4Fe-4S] cluster has been obtained. The 6Fe cluster of HydF has been also prepared chemically with diiron complexes mimicking the active site of HydA. The metallo-cofactors have been spectroscopically characterized (EPR, FTIR, HYSCORE), hydrogenase activities evaluated.

Les centres FeS sont un des cofacteurs protéiques majeurs, ils se trouvent aussi bien chez les bactéries que chez les eucaryotes. Ils ont des rôles essentiels de transfert d'électron, liaison de substrat et son activation, régulation d'expression de gènes, donneur de soufre etc. Leur agencement est très varié, allant du centre [2Fe-2S] à l'agrégat plus complexe MoFe7S9X (X = C, N ou O) de la nitrogénase. L'assemblage de ces centres se fait par des machineries protéiques. Nous avons étudié le système ISC (Iron-Sulfur Cluster) chez les bactéries, qui fabrique des centres [2Fe-2S] et [4Fe-4S]. Il est composé des protéines IscS, IscU, IscA, HscA, HscB et d'une ferrédoxine. Deux de ces protéines, IscS, qui est une cystéine désulfurase et IscU, protéine dite échafaudage, sont le cœur de la machinerie puisque IscS apporte le soufre sur la protéine IscU, qui, avec le fer qu'elle aura obtenu d'une autre protéine (non clairement identifiée à ce jour), fabriquera le centre fer-soufre et le transfèrera à une apoprotéine. Nous avons isolé un complexe stable (IscS-D35A-IscU)2 contenant un centre [2Fe-2S] dans des conditions anaérobie. Différentes formes du complexe ont été obtenues et cristallisées afin d'obtenir leurs structures, résolues par remplacement moléculaire. Ces structures nous ont permis de proposer un mécanisme d'assemblage des centres [2Fe-2S] à l'échelle atomique et électronique. Nous avons d'autre part étudié la protéine HmdB probablement impliquée dans la maturation de l'hydrogénase à fer. HmdB fait partie de la superfamille des protéines à radical SAM. Des cristaux de l'apoprotéine ont été obtenus et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Même si une partie de la structure n'est pas visible du fait de l'absence de centre [4Fe-4S], elle donne une première vue du site actif de la protéine. / FeS clusters are widely used protein cofactors, found both in bacteria and eukaryotes. They play key roles such as electron transfer, substrate binding and activation, regulation of gene expression, sulfur donor etc. They are really various, ranging from the [2Fe-2S] cluster to the more complex MoFe7S9X (X = C, N or O) agregate of nitrogenase. Clusters assembly is carried out by protein machineries. We studied the ISC (Iron-Sulfur Cluster) in bacteria, who assembles [2Fe-2S] and [4Fe-4S] clusters. It is composed of IscS, IscU, IscA, HscA, HscB proteins and a ferredoxin. Two of these proteins: the cysteine desulfurase IscS, and the scaffold protein IscU, represent the core of the machinery as IscS provides sulfur protein on IscU, which, with iron obtained from another protein (not clearly identified to date), assemble the iron-sulfur center. The latter transfers it to an apoprotein. We isolated under anaerobic conditions a stable (IscS-D35A-IscU)2 complex containing a [2Fe-2S] cluster. Different forms of the complex were obtained and their structures were solved by molecular replacement. These structures allowed us to propose a mechanism for the assembly of the [2Fe-2S] clusters at the atomic and electronic levels. We have also studied the HmdB protein, which is proposed to maturate the [Fe]-hydrogenase. HmdB is a member of the radical SAM proteins superfamily. Crystals of the apoprotein were obtained and its structure was solved by molecular replacement. Although part of the structure is not visible due to the absence of the [4Fe-4S] cluster, this structure gives a first view of the active site of the protein.

Il existe dans la Nature des métalloenzymes, les hydrogénases, capables de produire et consommer du dihydrogène de façon catalytique. La résolution des structures de ces hydrogénases a révélé la présence de sites actifs de nature organométallique, pouvant-être décrits comme des entités bimétalliques à base de fer et de nickel. Dès lors, de nombreux complexes dinucléaires du fer ont été synthétisés en vue de comprendre et de reproduire les processus de conversion H+/H2 réalisés par les hydrogénases [FeFe]. En particulier, des composés dithiolato-pontés dinucléaires du fer, possédant des ligands bidentates ont été élaborés suite aux résultats d'études théoriques ayant proposé qu'une disubstitution dissymétrique sur un des atomes de fer de ces molécules pouvait permettre de reproduire certaines caractéristiques structurales clés du site actif. Une partie des travaux décrits dans ce mémoire s'inscrit dans la suite des études entreprises dans le laboratoire concernant l'utilisation de ligands bidentates chélatants dans des complexes dinucléaires du fer inspirés par le site actif des hydrogénases [FeFe], comme la 1,10-phénanthroline ou encore les diphosphines. L'autre partie concerne le développement d'une voie de synthèse systématique pour l'obtention de complexes trinucléaires originaux du fer présentant un agencement quasi-linéaire des trois atomes de fer. Le comportement électrochimique des espèces synthétisées ainsi que leur réactivité en milieu acide ont été étudiés. / Hydrogenases are metalloenzymes found in Nature which are able to catalyse the production and the uptake of dihydrogen. Reports orr the structures of these hydrogénases have revealed the organometallic nature of their active sites, which are based on bimetallic assemblies containing nickel and iron atoms. Therefore, many diiron complexes have been synthesized in order to understand and to reproduce the high efficiency of [FeFe]- hydrogenases towards the reversible conversion of protons into dihydrogen. In particular, dithiolato-bridged diiron compounds, with bidentate ligands, have been developed in reason of results of theoretical studies which have suggested that an asymmetrical disubstitution at one iron atom of such bioinspired molecules may allow to reproduce some structural key features of the active site. One part of the works reported in this thesis concems pursuing studies previously undertaken in the laboratory on the use of bidentate chelating ligands with diiron bioinspired models of [FeFe] hydrogenases, such as 1,10- phenanthroline or diphosphines. Another part reports the development of a systematîc way for the synthesis of original trinuclear iron clusters having a quasi-linear arrangement of the three iron atoms. Electrochemical behaviours of the synthesized species as well as their reactivity in acidic medium have been studied.

Les hydrogénases FeFe sont des métalloenzymes qui catalysent l'oxydation et la production de H$_2$. Le cycle catalytique et de nombreux aspects de la réactivité de ces enzymes, y compris l'inactivation aérobie et anaérobie, ne sont toujours pas complètement compris. J'ai développé une nouvelle technique appelée photo-électrochimie directe et je l'ai utilisée pour étudier l'effet de l'irradiation sur la cinétique d'inhibition par le CO de trois hydrogénases FeFe distinctes. J'ai déterminé le spectre d'action de la photo-dissociation de l'inhibiteur CO et j'ai décrit le processus au niveau QM pour la première fois, en obtenant un bon accord entre les expériences et la théorie.J'ai également étudié la photoinhibition de l'enzyme. J'ai effectué des expériences de photoélectrochimiques en irradiant la protéine avec des diodes laser monochromatiques dans le domaine de la lumière visible, une lampe halogène ou une lampe au xénon et j'ai observé que les hydrogénases FeFe de C. reinhardtii et C. acetobutylicum sont irréversiblement inactivées par la lumière UVB. En utilisant la DFT et la TDDFT, j'ai conclu que les étapes initiales de la photoinhibition consistent en la photodissociation d'un ligand carbonyle intrinsèque du site actif, suivie de la formation d'une espèce inactive stable.J'ai aussi effectué des expériences préliminaires pour examiner l'effet de la lumière sur l'activité de deux autres métalloenzymes: la CO déshydrogénase et la hydrogénase NiFe.Mes résultats illustrent la force de l'approche méthodologique qui combine électrochimie directe et TDDFT, et apportent de nouvelles connaissances sur les propriétés chimiques et photochimiques de plusieurs métalloenzymes. / FeFe hydrogenases are metalloenzymes that catalyze the oxidation and production of H$_2$. The catalytic cycle and many aspects of the reactivity of these enzymes, including their aerobic and anaerobic inactivation, are still the subjects of intense investigations. I developed a new technique called direct photo-electrochemistry and I used it to study the effect of monochromatic irradiation in the visible range on the kinetics of inhibition by CO of three distinct FeFe hydrogenases. I determined the action spectrum of the photo-dissociation of the inhibitor CO and I described the process at the QM level for the first time, obtaining good agreement between experiments and theory.I also studied the photoinhibition of the enzyme. I carried out photoelectrochemistry experiments irradiating the protein with monochromatic visible light laser diodes, a halogen lamp or a xenon lamp, and I observed that the FeFe hydrogenases from C. reinhardtii and C. acetobutylicum are irreversibly inactivated by UVB light. Using DFT and TDDFT, I concluded that the initial steps of photoinhibition consist in the photodissociation of one carbonyl intrinsic ligand of the active site, followed by the formation of a stable inactive species.I also performed preliminary experiments to examine the effect of light on the activity of two other metalloenzymes: Carbon monoxide dehydrogenase (CODH) and NiFe-hydrogenase.My results illustrate the strength of the methodological approach that combines direct electrochemistry and TDDFT, and reveal new insights in the chemical and photochemical properties of several metalloenzymes.

Source d'énergie renouvelable et non polluante, le biohydrogène connaît un intérêt croissant. En culture continue sur glucose, la productivité d'hydrogène la plus élevée est réalisée par la bactérie anaérobie Clostridium acetobutylicum avec 2,4 litres d'hydrogène produit l-1 h-1. Cette production d'hydrogène est catalysée par la [FeFe]-hydrogénase HydA. Pour comprendre et améliorer les capacités de ce micro-organisme pour la production d'hydrogène, nous avons voulu caractériser les relations structure-fonctions de HydA avec ses partenaires d'oxydo-réduction. Par homologie avec l'hydrogénase à fer I de Clostridium pasteurianum, les centres [4Fe-4S] FS4C et [2Fe-2S] FS2, situés en surface de la protéine, pourraient être impliqués dans le transfert inter-moléculaire d'électrons entre HydA et ses partenaires d'oxydoréduction. Notre objectif a alors été de déterminer l'implication de FS4C et FS2 dans ce transfert. Pour cela, des mutations par substitutions d'acides aminés et par délétions de domaines ont été effectuées au niveau de FS4C et FS2. Pour palier des problèmes d'instabilité des hydrogénases à fer native et modifiées, le protocole de purification a été amélioré. L'hydrogénase native a nettement été stabilisée, mais l'instabilité persistante des hydrogénases modifiées est restée une limitation importante pour leur caractérisation catalytique. La perte d'activité des hydrogénases modifiées a pu être corrélée à une perte importante de fonctionnalité de leur site actif et à un nombre d'atomes de fer incorporés inférieur à la valeur théorique. Les partenaires physiologiques d'oxydo-réduction de HydA chez C. acetobutylicum, la ferrédoxine CAC0303 et la flavodoxine, ont été purifiés. Le profil catalytique complet et les paramètres cinétiques des activités de consommation et de production d'hydrogène de HydA native avec différents partenaires d'oxydo-réduction ont été déterminés. L'amélioration du protocole de purification a permis d'augmenter significativement les activités de consommation et production d'hydrogène. Nous avons confirmé la préférence in vitro de HydA à catalyser la consommation de l'hydrogène par rapport à la production. Une valeur très élevée de kcat a été obtenue avec le substrat artificiel, méthyl viologène, en consommation d'hydrogène. Cela semble indiquer que le méthyl viologène pourrait interagir plus ou moins directement avec le site actif de l'enzyme, en évitant le transfert intramoléculaire d'électrons. Des efficacités catalytiques élevées de consommation et de production de l'hydrogène ont été obtenues avec le méthyl viologène (sauf sous sa forme réduite), la ferrédoxine et la flavodoxine. Ce résultat reflète le haut potentiel de HydA pour les réactions liées à l'hydrogène, potentiel conservé aussi bien pour ses partenaires redox physiologiques qu'artificiel. Ainsi, en condition de croissance en carence en fer, la substitution de la ferrédoxine par la flavodoxine ne serait pas une limitation pour l'activité hydrogénase in vivo.

Ce mémoire est consacré au développement d'assemblages hybrides à base de biomolécules et de polymères avec ou sans nanotubes de carbone en vue de leur application dans des domaines tels que les biocapteurs ou les biopiles. Dans un premier temps, le poly(pyrrole-NTA)/Cu2+ a été utilisé pour l'élaboration de capteurs à ADN ou de biocapteurs enzymatiques. Ainsi, il a pu être utilisé avec son partenaire d'affinité, l'histidine, pour l'immobilisation réversible d'oligonucléotides sondes marqués avec des histidines. Grâce à une détection sans marquage de la cible, la spectroscopie d'impédance électrochimique, le plus faible seuil de détection de la littérature (10-15 mol.L-1) pour les biocapteurs à détection impédancemétrique a été décrit. Par la suite, un concept totalement novateur et original a été étudié pour l'utilisation ce polymère afin de réaliser l'immobilisation de biomolécules biotinylées. Cette nouvelle interaction NTA/Cu2+/biotine a été illustrée par l'ancrage d'enzymes et d'oligonucléotides marqués avec des biotines. Dans un second temps, des architectures tridimensionnelles à base de nanotubes de carbone fonctionnalisés de façon non-covalente ont été considérées. Tout d'abord, la fonctionnalisation multiple de nanotubes de carbone par interactions - avec des pyrènes modifiés en utilisant les trois systèmes affins les plus courants (adamantane/-cyclodextrine, avidine/biotine et NTA/Cu2+/histidine) a été entreprise. Cette étude a permis d'ouvrir de nombreuses perspectives dans le domaine des biocapteurs ou des biomatériaux. Ensuite, la connexion d'une hydrogénase sur des matériaux hybrides polymère rédox/nanotubes de carbone a été réalisée. Bien que ce ne soit qu'une étude préliminaire, les résultats obtenus ont montré l'efficacité de ce type d'architecture pour la production d'énergie propre à partir du dihydrogène.

A l'heure actuelle la recherche de nouvelles ressources énergétiques est un domaine en plein développement. Dans ce cadre, l'hydrogène moléculaire y a toute sa place et sera un vecteur énergétique majeur du XXIème siècle en permettant le stockage des énergies renouvelables. Cependant son utilisation est pour l'instant limitée à cause du coût élevé de sa production, industriellement basée sur le platine comme catalyseur. Un des enjeux majeurs de ce siècle est donc de trouver de nouveaux catalyseurs performants pour la production d'hydrogène et dont le coût soit suffisamment faible pour permettre un développement industriel. Les hydrogénases sont des enzymes catalysant la réduction de protons en hydrogène avec une grande efficacité et en conditions douces. Leurs sites actifs sont basés sur des métaux abondants comme le nickel ou le fer et ont des activités similaires au platine dans certaines conditions. Cependant quelques inconvénients, comme leur inactivation par l'oxygène ou encore le fait qu'il soit assez difficile de les produire sous forme active, limitent leur utilisation technologique. Dans ce contexte, la chimie bio-inspirée et la chimie biomimétique sont particulièrement prometteuses : prenant exemple sur la nature et plus particulièrement sur les sites actifs enzymatiques, elles permettent de développer de nouvelles familles de catalyseurs. On a pu ainsi développer des complexes dinucléaire nickel-fer ou encore des complexes de cobalt ayant une activité dans la catalyse de réduction de protons. Certains complexes de cobalt, les cobaloximes et les complexes diimine dioxime de cobalt ont ainsi montré de bonnes activités dans la réduction de protons en milieux organiques ou mixtes organiques/eau. Jusqu'alors cependant peu d'études ont été effectuées en milieux complétement aqueux. Nous pouvons aller plus loin dans cette démarche via une approche dite biosynthétique, qui vise à incorporer des catalyseurs inorganiques dans des enveloppes protéiques. Ces enveloppes protéiques peuvent, par différentes interactions, potentiellement améliorer la solubilité et la stabilité dans l'eau des catalyseurs inorganiques. La thèse qui suit se concentre sur cette approche et plus particulièrement sur la production, la caractérisation et l'étude de nouveaux hybrides entre différentes hémoprotéines (myoglobine et hème oxygénase en particulier) et différents complexes de cobalt (cobaloximes et complexe diimine dioxime de cobalt). Après avoir mis au point un protocole pour la production et la purification de la myoglobine de cachalot sans son cofacteur héminique, nous nous sommes intéressés à préparer et caractériser différents hybrides. Nous avons pu montrer par ce travail que les hémoprotéines dépourvues de leur cofacteur biologique ont une affinité particulière pour les complexes de cobalt et que la coordination de ces complexes inorganiques se fait via une seule histidine de la protéine hôte. Les hybrides ainsi obtenus ont montré une grande stabilité en solution. En plus de l'ajout d'un ligand histidine en axial du cobalt, l'enveloppe protéique permet de moduler la seconde sphère de coordination. Nous avons pu montrer au cours de ce projet que la nature de la protéine hôte module les caractéristiques spectroscopiques et électrochimiques du complexe de cobalt. Enfin ces hybrides ont montré d'une manière générale une activité catalytique pour la production et la photoproduction d'hydrogène dans l'eau, là encore avec une nette influence de la protéine hôte sur l'activité du complexe. Nous avons donc au cours de cette thèse préparé et caractérisé des systèmes hybrides pouvant être qualifiés d'hydrogénases artificielles.