A l'heure actuelle la recherche de nouvelles ressources énergétiques est un domaine en plein développement. Dans ce cadre, l'hydrogène moléculaire y a toute sa place et sera un vecteur énergétique majeur du XXIème siècle en permettant le stockage des énergies renouvelables. Cependant son utilisation est pour l'instant limitée à cause du coût élevé de sa production, industriellement basée sur le platine comme catalyseur. Un des enjeux majeurs de ce siècle est donc de trouver de nouveaux catalyseurs performants pour la production d'hydrogène et dont le coût soit suffisamment faible pour permettre un développement industriel. Les hydrogénases sont des enzymes catalysant la réduction de protons en hydrogène avec une grande efficacité et en conditions douces. Leurs sites actifs sont basés sur des métaux abondants comme le nickel ou le fer et ont des activités similaires au platine dans certaines conditions. Cependant quelques inconvénients, comme leur inactivation par l'oxygène ou encore le fait qu'il soit assez difficile de les produire sous forme active, limitent leur utilisation technologique. Dans ce contexte, la chimie bio-inspirée et la chimie biomimétique sont particulièrement prometteuses : prenant exemple sur la nature et plus particulièrement sur les sites actifs enzymatiques, elles permettent de développer de nouvelles familles de catalyseurs. On a pu ainsi développer des complexes dinucléaire nickel-fer ou encore des complexes de cobalt ayant une activité dans la catalyse de réduction de protons. Certains complexes de cobalt, les cobaloximes et les complexes diimine dioxime de cobalt ont ainsi montré de bonnes activités dans la réduction de protons en milieux organiques ou mixtes organiques/eau. Jusqu'alors cependant peu d'études ont été effectuées en milieux complétement aqueux. Nous pouvons aller plus loin dans cette démarche via une approche dite biosynthétique, qui vise à incorporer des catalyseurs inorganiques dans des enveloppes protéiques. Ces enveloppes protéiques peuvent, par différentes interactions, potentiellement améliorer la solubilité et la stabilité dans l'eau des catalyseurs inorganiques. La thèse qui suit se concentre sur cette approche et plus particulièrement sur la production, la caractérisation et l'étude de nouveaux hybrides entre différentes hémoprotéines (myoglobine et hème oxygénase en particulier) et différents complexes de cobalt (cobaloximes et complexe diimine dioxime de cobalt). Après avoir mis au point un protocole pour la production et la purification de la myoglobine de cachalot sans son cofacteur héminique, nous nous sommes intéressés à préparer et caractériser différents hybrides. Nous avons pu montrer par ce travail que les hémoprotéines dépourvues de leur cofacteur biologique ont une affinité particulière pour les complexes de cobalt et que la coordination de ces complexes inorganiques se fait via une seule histidine de la protéine hôte. Les hybrides ainsi obtenus ont montré une grande stabilité en solution. En plus de l'ajout d'un ligand histidine en axial du cobalt, l'enveloppe protéique permet de moduler la seconde sphère de coordination. Nous avons pu montrer au cours de ce projet que la nature de la protéine hôte module les caractéristiques spectroscopiques et électrochimiques du complexe de cobalt. Enfin ces hybrides ont montré d'une manière générale une activité catalytique pour la production et la photoproduction d'hydrogène dans l'eau, là encore avec une nette influence de la protéine hôte sur l'activité du complexe. Nous avons donc au cours de cette thèse préparé et caractérisé des systèmes hybrides pouvant être qualifiés d'hydrogénases artificielles. / Hydrogen production, through the reduction of water in electrolysers, is currently one of the most convenient ways to store energy durably, if the electrical energy is initially obtained from renewable resources. However, while electrolysis is a mature and robust technology, the most promising devices, based on proton exchange membranes, relay on the use of platinum as electrocatalyst to accelerate both hydrogen evolution and water oxidation reactions. This rare and expensive metal is not itself a renewable resource, so the viability of a hydrogen economy depends on the design of new efficient and robust electrocatalytic materials based on earth-abundant elements. A competitive alternative to platinum could be found in living micro-organisms metabolizing hydrogen thanks to hydrogenases. Catalysis in hydrogenases only requires base-metal centers (nickel and iron) thus holding promises for the development of earth-abundant H2-evolving catalysts but these enzymes are highly oxygen sensitive and difficult to rproduce in large quantities under an active form. Biomimetic and bioinspired chemistry can use the structure of their active sites as an inspiration to design new synthetic catalysts and could produce dinuclear nickel –ion or diiron and cobalt complexes as active H2 evolving catalysts, respectively. In particular cobaloximes and cobalt diimine–dioxime complexes are efficient and stable electro-catalysts for hydrogen evolution form acidic nonaqueous solutions or in mixtures of water and a non-aqueous solvent. Until now, only few studies on H2 evolution catalyzed by these Co complexes have been reported. In this work we use the biosynthetic approach, consisting in producing biohydrid systems combining a synthetic catalyst with a host protein. The protein framework is expected to provide the catalyst with enhanced solubility in water, to proect it against side reactions leading to decomposition and, ultimately to improve its catalytic performances. We selected hemoproteins (myoglobin and heme oxygenase) as host proteins and studied the formation of adducts with cobaloximes and cobalt diimine–dioxime complexes. We first describe the method used to produce the apo-form of myoglobin ( ie the protein without its naturel cofactor, heme) and then describe the preparation and characterization of various hybrids in which the cobalt complexes are bound to the protein thanks to the coordination of the imidazole group of a histidine residue. The hybrids proved stable in solution and display catalytic activity for hydrogen production in fully aqueous solution. We also showed that the protein framework tunes the catalytic activity for of the cobalt complex. These novel biohybrids can thus be named as artificial hydrogenases.

: Chez la bactérie Clostridium acetobutylicum, la production de dihydrogène est catalysée par des hydrogénases, enzymes impliquées dans l’oxydation de la ferrédoxine réduite, qui permet la réduction des protons et la formation du gaz. Toutes les hydrogénases à fer partagent un domaine protéique très conservé (le Domaine H), hébergeant le site catalytique inorganique (le Cluster H). L’enzyme CaHydA de C. acetobutylicum, possède également le Domaine F contenant en tous quatre centres fer-soufre dits accessoires. Au cours de ces travaux, l’implication des centres fer-soufre du Domaine F sur les capacités catalytiques de l’enzyme a été étudiée, ainsi que les mécanismes de transfert d’électrons entre l’enzyme et son partenaire physiologique d’oxydoréduction principal : la ferrédoxine 2[4Fe-4S]. Différents variants ciblés de l’hydrogénase ont été créés, produits puis purifiés afin de les caractériser par une combinaison de méthodes biochimiques, électrochimiques, spectroscopiques et de modélisation moléculaire. Ceci a permis de mettre en évidence pour la première fois l’implication des centres fer-soufre accessoires du Domaine F dans les capacités catalytiques de l’enzyme. Enfin, il a été démontré que le centre [2Fe-2S] de surface FS2 de l’enzyme était le point d’entrée des électrons provenant de la ferrédoxine réduite. / The hydrogenase of Clostridium acetobutylicum catalyses the oxydation of reduced ferredoxin, leading to reduction of protons and dihydrogen formation. Among the three different classes of hydrogenases, the [Fe-Fe] Hydrogenases harbor a very conserved domain (H-Domain) containing the inorganic catalytic site (Cluster H). CaHydA from C. acetobutylicum possesses, in addition, the F-Domain containing four accessory iron-sulfur clusters. The involvement of accessory iron-sulfur cluster of F-Domain on the catalytic capacities of the enzyme has never been assessed. Moreover, which of the two surface iron-sulfur cluster of the F-Domain who interacts with the physiological redox partner ferredoxin is unknown. Different CaHydA mutants enzymes, modified in the Fe-S cluster composition of the F-Domain have been purified, and spectroscopically, biochemically and electrochemically characterized. These mutants enzymes, impaired in their catalytic activity both in solution and wired to an electrode, suggested, for the first time that the Fe-S clusters of the F-Domain have a long-range thermodynamic effect on the H-cluster and modulate enzyme’s functions. Moreover, it has been shown, and confirmed by molecular modelling, that the [2Fe-2S] surface cluster FS2 of the enzyme is the entry point for the electrons coming from the reduced ferredoxin.

Grâce au récent développement des synthèses chimiques en suspension colloïdale, de nouveaux photosensibilisateurs possédant une grande surface spécifique ont été envisagés dans cette thèse pour supporter des réactions d'oxydoréduction induite par la lumière. Ce travail s'inscrit donc dans la recherche de nouvelles sources d'énergie pour répondre aux problèmes inhérents à l'appauvrissement des énergies fossiles. Ainsi des nanobâtonnets quantiques de composition cœur@coquille et des nanobâtonnets d'or ont été synthétisés. Leur anisotropie de forme permet également de les assembler dans des phases cristal liquides. Grâce à une méthode de séchage originale, des assemblages hiérarchiques ont été obtenus, ce qui est prometteur pour réaliser des réactions de photocatalyses sur ces assemblages par la suite. Par ailleurs, un catalyseur naturel, une hydrogénase, a été greffée avec succès sur les nanocristaux et étudié en électrochimie. Ces systèmes permettraient d'améliorer les performances des biopiles à combustibles. / With the recent development of chemical synthesis in colloidal suspension, new photosensitizers with high surface area have been considered in this thesis to support redox reactions induced by light. This work is therefore in the scope of finding new energy sources to meet the problems posed by the depletion of fossil fuels. Quantum nanorods with a core@shell composition and gold nanorods were synthesized. Their shape anisotropy permits to assemble them in liquid crystal phases. Thanks to an original method of drying, hierarchical assemblies were obtained, which is promising to perform photoredox reactions on these assemblies thereafter. Furthermore, a natural catalyst, a hydrogenase was successfully grafted onto the nanocrystals and studied in electrochemistry. These systems would improve the performance of biofuel cells.

Les microorganismes photosynthétiques suscitent un intérêt biotechnologique important pour la production de dihydrogène. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803 est capable d'initier une photoproduction d'hydrogène catalysée par une hydrogénase [NiFe] bidirectionnelle qui se présente sous la forme d'un complexe pentamérique (HoxEFUYH). Toutefois l'inhibition de cette enzyme par l'oxygène émis par le photosystème II rend cette photoproduction transitoire et constitue un verrou majeur au développement de tels procédés. L'exploitation de ces organismes impose une meilleure compréhension des bases moléculaires associées à la sensibilité de l'hydrogénase envers l'oxygène ainsi que des composantes limitant son activité de production d'H2, ce qui implique la connaissance détaillée des jeux d'interactions avec ses partenaires physiologiques NAD(P)+/NAD(P)H.Diverses substitutions d'acides aminés potentiellement impliqués dans la sensibilité de l'enzyme à l'O2 et situés au cœur du site actif (Ileu64, Leu107, Leu112) de la sous-unité catalytique HoxH ont été réalisées. Les résultats in vitro et in vivo indiquent une sensibilité envers l'O2 moindre chez le mutant I64M, qui présente une diffusion limitée et un biais vers l'activité de production d'H2.L'étude des interactions de mutants de délétion des gènes diaphorase hoxE et hoxF avec les cofacteurs NAD(P) a montré que NAD+/NADH semblent être les partenaires privilégiés de l'hydrogénase pour le transfert d'électrons, tandis que le NADPH a un effet activateur sur l'enzyme.Ces études apportent des éléments importants pour envisager une optimisation ciblée et maîtrisée pour la bioproduction d'H2. / Oxygenic photosynthetic organisms are a matter of great biotechnological interest for the production of dihydrogen using what seem to be infinite resources, water and solar energy. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 encodes a bidirectional [NiFe] hydrogenase consisting of a pentameric complex (HoxEFUYH) that allows it to carry H2 photoproduction. However, it is a transient process, mainly due to the oxygen sensitivity of hydrogenases, O2 being produced at PSII during photosynthesis. Future exploitation of these organisms in bioprocesses requires a better understanding of the molecular bases of O2 sensitivity of the hydrogenase and of the elements limiting H2 evolution which involves detailed knowledge of the interactions of the enzyme with its physiological partners NAD(P)+/NAD(P)H.Various mutants of the Synechocystis hydrogenase were created by genetic engineering, targeting specific amino acid residues (Ileu64, Leu107, Leu112) in the catalytic subunit HoxH identified as putative critical elements for O2 sensitivity. Results obtained in vitro and in vivo indicate that the substitution I64M slightly improves O2 tolerance and alters gas diffusion kinetics with a bias towards H2 production. Studying the interaction of diaphorase gene-deletion mutants hoxF and hoxE with partners NAD(P) showed that NAD+/NADH are the preferential electron acceptor/donor of the hydrogenase, while NADPH is more efficient for enzyme activation.These studies provide first insights on the determinants of the oxygen sensitivity of the hydrogenase of Synechocystis and its activation, which are critical elements to consider in targeted optimization for bioproduction of H2.

Parmi les technologies basées sur H2 comme vecteur d’énergie, les biopiles à combustibles utilisant des enzymes comme biocatalyseurs spécifiques et efficaces au lieu des catalyseurs au platine apparaissent comme des alternatives émergentes. L’objectif de cette thèse est de comprendre les paramètres gouvernant l’immobilisation fonctionnelle sur des interfaces nanostructurées d'enzymes spécifiques de l’oxydation de H2 et de la réduction d’O2 en vue de désigner une biopile H2/O2 performante.Divers nanomatériaux sont caractérisés, nanoparticules d’or (AuNP) et nanotubes de carbone (CNT), présentant différentes tailles et chimie de surface, aptes à développer des ratios importants surface/volume, autorisant une augmentation du nombre de molécules enzymatiques incorporées et donc une augmentation des courants catalytiques. L’immobilisation des enzymes sur AuNP a permis de discriminer entre l’augmentation de surface ou un effet nano sur l’efficacité catalytique. L’étude intégrée sur CNT, avec les charges de l’interface électrochimique, les charges et moments dipolaires des enzymes considérées, a permis de démontrer que les interactions électrostatiques contrôlent le processus de transfert d’électrons. Cette étude montre que les bases moléculaires pour une immobilisation efficace des enzymes, obtenues sur monocouches est applicables aux réseaux 3D.La détermination des nanostructures optimales pour les réactions enzymatiques est étudiée pour un changement d’échelle. Ainsi des feutres de carbone sont fonctionnalisés avec les nanostructures adaptées, pour au final développer la première biopile H2/O2 capable d’alimenter un multicapteur et un système de communication sans fil. / Among the technologies based on H2 as an energy carrier, biofuel cells that use specific and effective enzymes as biocatalysts instead of platinum catalysts appear as emerging alternative. The objective of this thesis is to understand the parameters governing the functional immobilization of specific enzymes for H2 oxidation and O2 reduction reactions on nanostructured interfaces, aimed to design a performant H2 / O2 biofuel cell.Gold nanoparticles (AuNP) and carbon nanotubes (CNT) having different sizes and surface chemistry are characterized. These nanomaterials develop important ratios surface / volume ratio, allow an increment in the number of enzyme molecules immobilized and therefore an increase catalytic currents. The immobilization of enzymes on AuNP allowed the discrimination between the increase in surface area and a nanomaterial effect on catalytic efficiency. The study on CNT integrates the charge of the electrochemical interface, dipole moments and the surface charge of enzymes. It demonstrated that electrostatic interactions control the electron transfer process. This study shows that the molecular basis for effective immobilization of enzymes, obtained on monolayers is applicable to 3D networks.The determination of the best parameters for enzymatic reactions, allows the development of an optimized 3-D volumetric interface based on carbon felt. We finally design for the first time a H2/O2 biofuel cell able to generate enough electric power to feed a complete wireless communication device.

Pour assurer l'avenir énergétique de l'humanité, il est vital de se tourner vers d'autres ressources que les combustibles fossiles. La photosynthèse est un système efficace élaboré sur des centaines de millions d'années pour convertir l'énergie lumineuse en énergie chimique. <br />Certaines algues sont capables de produire de l'hydrogène à partir d'eau en utilisant des chaînes photosynthétiques pour alimenter des enzymes, les hydrogénases, qui catalysent la formation d'hydrogène gazeux. Cette thèse s'inscrit dans un projet d'étudier et de comprendre ces systèmes pour être en mesure d'imiter leurs fonctions avec des systèmes artificiels. <br />Au cours de cette thèse, des chaînes de transferts d'électrons impliquant des protéines photosynthétiques (photosystème I) et leurs partenaires ont été étudiées ex-vivo dans des cellules électrochimiques par voltamétrie cyclique. L'activité catalytique des photosystèmes sous éclairement permet d'obtenir un transfert linéaire d'électrons depuis l'électrode jusqu'à un accepteur final. <br />Une méthode fondée sur les mesures de courants photocatalytiques a été mise au point et utilisée pour explorer les interactions de différents partenaires de la chaîne photosynthétique. Il a été montré qu'il est possible de choisir la réaction de la chaîne à étudier par cette méthode en adaptant les concentrations des différents partenaires. Cette méthode a été appliquée avec succès à l'étude des partenaires directs du photosystème I et à l'élucidation de certains aspects du fonctionnement de la ferrédoxine:NADPH oxydoréductase. Ces résultats s'annoncent prometteurs pour l'étude des hydrogénases par la même technique.

Les centres FeS sont un des cofacteurs protéiques majeurs, ils se trouvent aussi bien chez les bactéries que chez les eucaryotes. Ils ont des rôles essentiels de transfert d'électron, liaison de substrat et son activation, régulation d'expression de gènes, donneur de soufre etc. Leur agencement est très varié, allant du centre [2Fe-2S] à l'agrégat plus complexe MoFe7S9X (X = C, N ou O) de la nitrogénase. L'assemblage de ces centres se fait par des machineries protéiques. Nous avons étudié le système ISC (Iron-Sulfur Cluster) chez les bactéries, qui fabrique des centres [2Fe-2S] et [4Fe-4S]. Il est composé des protéines IscS, IscU, IscA, HscA, HscB et d'une ferrédoxine. Deux de ces protéines, IscS, qui est une cystéine désulfurase et IscU, protéine dite échafaudage, sont le cœur de la machinerie puisque IscS apporte le soufre sur la protéine IscU, qui, avec le fer qu'elle aura obtenu d'une autre protéine (non clairement identifiée à ce jour), fabriquera le centre fer-soufre et le transfèrera à une apoprotéine. Nous avons isolé un complexe stable (IscS-D35A-IscU)2 contenant un centre [2Fe-2S] dans des conditions anaérobie. Différentes formes du complexe ont été obtenues et cristallisées afin d'obtenir leurs structures, résolues par remplacement moléculaire. Ces structures nous ont permis de proposer un mécanisme d'assemblage des centres [2Fe-2S] à l'échelle atomique et électronique. Nous avons d'autre part étudié la protéine HmdB probablement impliquée dans la maturation de l'hydrogénase à fer. HmdB fait partie de la superfamille des protéines à radical SAM. Des cristaux de l'apoprotéine ont été obtenus et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Même si une partie de la structure n'est pas visible du fait de l'absence de centre [4Fe-4S], elle donne une première vue du site actif de la protéine.

La corrosion induite par les micro-organismes (CIM) génère des pertes économiques mondiales chiffrées en milliards d’euros par an. Il est communément admis que les bactéries sulfato-réductrices (BSR) jouent un rôle clé dans la CIM anaérobie des aciers. Malgré cette unanimité, les essais en laboratoire peinent à reproduire la corrosion des aciers observées en milieu naturel; bien plus, ils n’expliquent pas quel est l’élément qui déclenche la corrosion, puisque les BSR présentes dans de nombreux environnements naturels n’induisent pas systématiquement de corrosion. L’objectif de ce travail est d’évaluer la pertinence dans le domaine de la CIM de nouveaux mécanismes de transferts électroniques entre aciers et protéines ou cellules microbiennes. La première partie de la thèse évalue l’effet d’une [Fe]-hydrogénase sur les processus de corrosion anaérobie des aciers au carbone. L’hypothèse d’une catalyse directe de la réduction des protons par des hydrogénases adsorbées a souvent été suggérée dans la bibliographie, elle est ici clairement démontrée. L’hydrogénase de Clostridium acetobutylicum, qu’elle soit active, désactivée ou dénaturée accélère la corrosion de l’acier au carbone. La présence de phosphate dans le milieu rend les interprétations plus complexes mais ne modifie pas le mécanisme. Une nouvelle hypothèse est avancée qui donne un rôle essentiel aux centres fer-soufre de la protéine. La catalyse de la corrosion par les hydrogénases pourrait donc être rapprochée des mécanismes bien connus de catalyse par le sulfure de fer. Dans ce cas l’état redox des centres fer-soufre serait une clé essentielle de l’apparition ou non de la corrosion. La deuxième partie élucide le rôle de Geobacter sulfurreducens sur la corrosion anaérobie de trois types de matériaux : aciers au carbone (1145), ferritique (403) et austénitiques (304L et 316L). Les résultats mettent en évidence pour la première fois que des cellules bactériennes adhérées induisent un anoblissement du potentiel libre des aciers et accélèrent la corrosion des aciers faiblement alliés par un mécanisme de transfert direct d’électrons. Suivant les concentrations d’accepteurs et de donneurs d’électrons en solution, G. sulfurreducens peut accentuer la propagation de la corrosion en catalysant directement la réduction cathodique ou, au contraire, en absence d’accepteurs et en excès de donneurs, protéger contre la corrosion. L’apparition de la corrosion ne peut donc être induite que par la conjonction défavorable de plusieurs paramètres. Ces résultats obtenus en laboratoire apportent de nouvelles voies d’investigations des phénomènes de CIM qui doivent maintenant être confrontées aux milieux naturels. / Microbially influenced corrosion (MIC) costs billions of euros per year. It is commonly agreed that sulphate-reducing bacteria (SRB) play a key role in anaerobic MIC of steels. In spite of this, laboratory experiments have difficulty in reproducing the corrosion of steels that is observed in natural environments. Moreover, they do not explain what triggers corrosion since SRB, ubiquitous in natural environments, do not systematically induce corrosion. The aim of this work was to evaluate the relevance of new electron transfer mechanisms between steels and proteins or microbial cells in the domain of MIC. The first part of the thesis evaluates the impact of [Fe]-hydrogenase on the anaerobic corrosion of mild steels. The direct catalysis of proton reduction by hydrogenases has often been suggested in the literature; here, it is clearly demonstrated. Hydrogenase from Clostridium acetobutylicum, whether it is active, deactivated on denatured, can accelerate the corrosion of mild steel. The presence of a phosphate medium makes the interpretations more complex without modifying the mechanism. A new hypothesis implying the crucial role of iron-sulphur clusters contained in the protein is brought to light. Corrosion catalysis by hydrogenases could be compared with well-known mechanisms of corrosion catalysis by iron sulphide. In this case, the redox state of iron-sulphur clusters would play a key role in the occurrence of corrosion. The second part elucidates the role of Geobacter sulfurreducens in anaerobic corrosion of three types of steels: mild steel (1145), ferritic (403) and austenitic steels (304L and 316L). Results show, for the first time, that adherent bacterial cells induce open circuit potential ennoblement of steels and accelerate the corrosion of slightly alloyed steels by a direct electron transfer mechanism. Depending on the concentrations of the electron acceptors and donors in the medium, G. sulfurreducens could either enhance corrosion propagation by direct catalysis of proton reduction or, in the absence of acceptors and with an excess of donors, protect against corrosion. Thus the occurrence of corrosion relies on the unfavourable conjunction of many parameters. These results obtained in laboratory conditions open new paths for investigating MIC in natural environments.

Les hydrogénases sont les enzymes responsables de la conversion de l'H2. De part leur efficacité et spécificité vis-à-vis de l'oxydation de l'H2, elles apparaissent comme des biocatalyseurs potentiels dans les biopiles à combustible. Dans cet objectif, nous avons étudié l'immobilisation fonctionnelle sur diverses électrodes de l'hydrogénase membranaire tolérante à l'O2 de la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus. Par une approche couplée d'électrochimie, de microscopie et de spectroscopie, il est montré que l'orientation de l'hydrogénase sur une électrode n'est pas contrôlée par des interactions électrostatiques mais hydrophobes. Ce contrôle est lié à l'environnement spécifique du dernier relais électronique en surface de l'enzyme. En particulier, l'hélice transmembranaire hydrophobe entourée de détergent est impliquée dans l'immobilisation. Cette orientation spécifique induit la nécessité d'un médiateur redox pour l'oxydation de l'H2 sur une interface hydrophobe. A contrario, l'hydrogénase adopte une multitude d'orientations sur surfaces chargées. Dans ces conditions, une connexion directe efficace des enzymes est obtenue, mais aussi l'augmentation du courant global par médiation de l'oxydation de l'H2. La définition des paramètres d'immobilisation de l'hydrogénase, a permis de développer des interfaces électrochimiques propres à l'augmentation des courants. En couplant une biocathode basée sur la bilirubin oxidase pour la réduction de l'O2, une biopile H2/O2 a été construite basée à l'anode sur l'hydrogénase d'Aquifex aeolicus. / Hydrogenases are the key enzymes for H2 conversion in many microorganisms. They present high specificity and efficiency towards H2 oxidations. Consequently, they appear as attracting biocatalysts in view of the development of biofuel cells. Within that goal, we have studied in this work the functional immobilization of O2-tolerant [NiFe] hydrogenase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Using electrochemistry, microscopy and spectroscopy, including PM-IRRAS, it is demonstrated that hydrogenase orientation on electrode interface is not controlled by electrostatic interactions but by hydrophobic interactions. The control of the orientation is driven by the environment of the last electron relay located at the surface of the enzyme. The hydrophobic transmembrane helix which is surrounded by neutral detergent is directly involved in the immobilization process. This specific orientation on hydrophobic interface induces the need for a redox mediator in order to achieve H2 oxidation. Conversely, hydrogenase adopts multiple orientations on charged interfaces. As a consequence, a direct and efficient connexion of enzymes is obtained, but also the increase in oxidation current is obtained due the mediated electrocatalysis. The determination of the best parameters for hydrogenase immobilization has allowed to develop new electrochemical interfaces, with increased current densities for H2 oxidation, and increased bioelectrode stability. By coupling a biocathode based on bilirubin oxidase for O2 reduction, a H2/O2 biofuel cell has been built with Aquifex aeolicus hydrogenase as the bioanode.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace. / Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies.