Dans les organismes photosynthétiques, la ferrédoxine:NADP oxydoréductase (FNR) fournit le NADPH nécessaire à l'assimilation du CO2, mais elle réduit aussi la ferrédoxine (Fd) à partir du NADPH. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC6803 contient deux isoformes de FNR : une forme courte (FNRS, 34 kDa) et une forme longue (FNRL, 46 kDa) qui est liée au phycobilisome (PBS), un complexe collecteur de lumière. Nous avons purifié un sous-complexe du PBS qui contient la FNRL (FNRL-PC) et comparé les propriétés enzymatiques de FNRL-PC à FNRS. Par rapport à FNRS, FNRL-PC présente des affinités plus faible/forte pour le NADPH/la Fd, conformément aux prédictions des activités relatives des deux isoformes. La plupart des différences observées sont attribuées à l'encombrement stérique amené par la phycocyanine dans FNRL-PC. En conditions de turnover multiple, les deux isoformes catalysent de la même manière la réduction de NADP+ et de plus le transfert d'électrons (TE) depuis Fdred est limitant à force ionique élevée. Lors d'études in vivo, nous avons observé une augmentation de l'oxydation du NADPH par TE respiratoire ou cyclique chez un mutant ne contenant que la FNRS et chez le type sauvage à faible CO2. Les mesures ont montré clairement que FNRS est impliqué dans ce TE alternative et nous proposons que FNRS constitue le module déshydrogénase de NDH-1. La localisation de la FNR et/ou la présence de substrats semblent être essentiels dans les rôles respectifs des isoformes de FNR in vivo. Des études futures devraient nous donner une vue plus complète des processus de TE in vivo et clarifier le rôle du TE dépendant du NADPH et favorisé par FNRS dans la réduction du pool de PQ

Dans les organismes photosynthétiques, la ferrédoxine:NADP oxydoréductase (FNR) fournit le NADPH nécessaire à l'assimilation du CO2, mais elle réduit aussi la ferrédoxine (Fd) à partir du NADPH. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC6803 contient deux isoformes de FNR : une forme courte (FNRS, 34 kDa) et une forme longue (FNRL, 46 kDa) qui est liée au phycobilisome (PBS), un complexe collecteur de lumière. Nous avons purifié un sous-complexe du PBS qui contient la FNRL (FNRL-PC) et comparé les propriétés enzymatiques de FNRL-PC à FNRS. Par rapport à FNRS, FNRL-PC présente des affinités plus faible/forte pour le NADPH/la Fd, conformément aux prédictions des activités relatives des deux isoformes. La plupart des différences observées sont attribuées à l'encombrement stérique amené par la phycocyanine dans FNRL-PC. En conditions de turnover multiple, les deux isoformes catalysent de la même manière la réduction de NADP+ et de plus le transfert d'électrons (TE) depuis Fdred est limitant à force ionique élevée. Lors d'études in vivo, nous avons observé une augmentation de l'oxydation du NADPH par TE respiratoire ou cyclique chez un mutant ne contenant que la FNRS et chez le type sauvage à faible CO2. Les mesures ont montré clairement que FNRS est impliqué dans ce TE alternative et nous proposons que FNRS constitue le module déshydrogénase de NDH-1. La localisation de la FNR et/ou la présence de substrats semblent être essentiels dans les rôles respectifs des isoformes de FNR in vivo. Des études futures devraient nous donner une vue plus complète des processus de TE in vivo et clarifier le rôle du TE dépendant du NADPH et favorisé par FNRS dans la réduction du pool de PQ.

: Chez la bactérie Clostridium acetobutylicum, la production de dihydrogène est catalysée par des hydrogénases, enzymes impliquées dans l’oxydation de la ferrédoxine réduite, qui permet la réduction des protons et la formation du gaz. Toutes les hydrogénases à fer partagent un domaine protéique très conservé (le Domaine H), hébergeant le site catalytique inorganique (le Cluster H). L’enzyme CaHydA de C. acetobutylicum, possède également le Domaine F contenant en tous quatre centres fer-soufre dits accessoires. Au cours de ces travaux, l’implication des centres fer-soufre du Domaine F sur les capacités catalytiques de l’enzyme a été étudiée, ainsi que les mécanismes de transfert d’électrons entre l’enzyme et son partenaire physiologique d’oxydoréduction principal : la ferrédoxine 2[4Fe-4S]. Différents variants ciblés de l’hydrogénase ont été créés, produits puis purifiés afin de les caractériser par une combinaison de méthodes biochimiques, électrochimiques, spectroscopiques et de modélisation moléculaire. Ceci a permis de mettre en évidence pour la première fois l’implication des centres fer-soufre accessoires du Domaine F dans les capacités catalytiques de l’enzyme. Enfin, il a été démontré que le centre [2Fe-2S] de surface FS2 de l’enzyme était le point d’entrée des électrons provenant de la ferrédoxine réduite. / The hydrogenase of Clostridium acetobutylicum catalyses the oxydation of reduced ferredoxin, leading to reduction of protons and dihydrogen formation. Among the three different classes of hydrogenases, the [Fe-Fe] Hydrogenases harbor a very conserved domain (H-Domain) containing the inorganic catalytic site (Cluster H). CaHydA from C. acetobutylicum possesses, in addition, the F-Domain containing four accessory iron-sulfur clusters. The involvement of accessory iron-sulfur cluster of F-Domain on the catalytic capacities of the enzyme has never been assessed. Moreover, which of the two surface iron-sulfur cluster of the F-Domain who interacts with the physiological redox partner ferredoxin is unknown. Different CaHydA mutants enzymes, modified in the Fe-S cluster composition of the F-Domain have been purified, and spectroscopically, biochemically and electrochemically characterized. These mutants enzymes, impaired in their catalytic activity both in solution and wired to an electrode, suggested, for the first time that the Fe-S clusters of the F-Domain have a long-range thermodynamic effect on the H-cluster and modulate enzyme’s functions. Moreover, it has been shown, and confirmed by molecular modelling, that the [2Fe-2S] surface cluster FS2 of the enzyme is the entry point for the electrons coming from the reduced ferredoxin.

Pour assurer l'avenir énergétique de l'humanité, il est vital de se tourner vers d'autres ressources que les combustibles fossiles. La photosynthèse est un système efficace élaboré sur des centaines de millions d'années pour convertir l'énergie lumineuse en énergie chimique. <br />Certaines algues sont capables de produire de l'hydrogène à partir d'eau en utilisant des chaînes photosynthétiques pour alimenter des enzymes, les hydrogénases, qui catalysent la formation d'hydrogène gazeux. Cette thèse s'inscrit dans un projet d'étudier et de comprendre ces systèmes pour être en mesure d'imiter leurs fonctions avec des systèmes artificiels. <br />Au cours de cette thèse, des chaînes de transferts d'électrons impliquant des protéines photosynthétiques (photosystème I) et leurs partenaires ont été étudiées ex-vivo dans des cellules électrochimiques par voltamétrie cyclique. L'activité catalytique des photosystèmes sous éclairement permet d'obtenir un transfert linéaire d'électrons depuis l'électrode jusqu'à un accepteur final. <br />Une méthode fondée sur les mesures de courants photocatalytiques a été mise au point et utilisée pour explorer les interactions de différents partenaires de la chaîne photosynthétique. Il a été montré qu'il est possible de choisir la réaction de la chaîne à étudier par cette méthode en adaptant les concentrations des différents partenaires. Cette méthode a été appliquée avec succès à l'étude des partenaires directs du photosystème I et à l'élucidation de certains aspects du fonctionnement de la ferrédoxine:NADPH oxydoréductase. Ces résultats s'annoncent prometteurs pour l'étude des hydrogénases par la même technique.

Les métalloprotéines contenant des centres Fe-S jouent un rôle important dans la<br />nature car elles sont impliquées dans des fonctions physiologiques essentielles telles que la<br />photosynthèse, la respiration et la fixation de l'azote.<br />Dans cette thèse, une ferrédoxine impliquée dans la biogenèse des centres Fe-S, et une<br />dioxygenase bactérienne jouant un rôle crucial dans la biodegradation des hydrocarbures<br />aromatiques ont fait l'objet d‘analyses structurales par cristallographie aux rayons X. La<br />structure d'une ferrédoxine de la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus, a été<br />résolue dans les états oxyde et réduit. De petits changements structuraux ont été observes lors de la réduction, notamment au voisinage du centre [2Fe-2S]. Ces changements sont compares a ceux décrits pour des ferrédoxines de structure similaire mais de fonction différente.<br />Une métalloprotéine plus complexe, appartenant a une grande famille de dioxygenases<br />bactériennes, a été étudiée pour son activité d'oxydation des hydrocarbures aromatiques<br />polycycliques (HAP). Cette enzyme a trois composantes, isolée d'une souche de<br />Sphingomonas dégradant les HAP comprend une oxydoréductase a NAD(P)H, une<br />ferrédoxine a centre [2Fe-2S], et composante oxygenase de six sous-unités assemblées en un hexamère de type α3β3. La composante oxygenase, appelée PhnI, contient une centre [2Fe-2S] de type Rieske et un ion ferreux par sous-unité α, qui ont été identifies par leur signature RPE. L'enzyme est douée d'une spécificité du substrat extrêmement large, puisqu'elle est capable d'hydroxyle toute une gamme de HAP fait de 2 a 5 cycles aromatiques, y compris des cancérogènes comme le benz[a]anthracene et le benzo[a]pyrene. Avec le naphtalène comme substrat, des mesures de cinétique ont montre que cette enzyme a un Km bas (0.92 WM) et une constante de spécificité de 2.0 WM-1. s-1. La proteine Phn1 a été cristallisée, et sa structure 3D a été résolue avec une résolution de 1.85 A. En dépit d'une modeste similitude de séquence avec des dioxygenases homologues, le repliement polypeptidique est très semblable.<br />Des différences ont toutefois été observées au niveau de la poche catalytique.<br />Les protéines sous forme cristallisée, notamment les protéines Fe-S, peuvent subir des<br />dommages dus au rayonnement X synchrotron, causant des artefacts lors de la détermination<br />de la structure. Pour essayer de palier cet inconvénient, des rayons X de très haute énergie (55 keV; 0.22 A), qui sont peu absorbes par les protéines, ont été utilises pour résoudre la<br />structure d'une proteine modèle, le lysozyme. Une structure a été établie pour la première fois<br />par cette approche, en utilisant les phases expérimentales obtenues par différentes méthodes.<br />Les applications potentielles en biologie structurale sont discutées.

Cette thèse traite de la biodégradation par les bactéries d'une catégorie de polluants appelés hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP. La bactérie Mycobacterium sp. 6PY1 a été isolée d'un sol pollué pour sa capacité à utiliser un HAP à 4 cycles, le pyrène, comme seule source de carbone et d'énergie. Pour comprendre comment le pyrène est métabolisé, l'identification des enzymes impliquées a été entreprise par une approche protéomique. Cette approche a notamment mis en évidence dans la souche 6PY1 deux arène dioxygénases, enzymes susceptibles de catalyser l'attaque initiale du pyrène. L'objectif de cette étude consistait à cloner les gènes de structure des arène dioxygénases identifiées chez Mycobacterium 6PY1, à surexprimer ces gènes en système hétérologue pour faciliter la purification des enzymes correspondantes, et à déterminer les propriétés biochimiques et catalytiques de ces enzymes. Les gènes pdoA1B1 codant la composante terminale d'une dioxygénase ont été clonés et surexprimés chez E. coli. Les propriétés catalytiques de cette enzyme, appelée Pdo1, ont été déterminées in vivo en dosant les produits d'oxydation de HAP composés de 2 à 4 cycles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). L'analyse de la sélectivité de l'enzyme, déterminée de cette façon montre que Pdo1 oxyde préférentiellement des HAP à 3 ou 4 cycles, comme le phénanthrène et le pyrène, mais n'attaque pas les di-aromatiques comme le naphtalène et le biphényle. La protéine Pdo1 s'est révélée instable et n'a été purifiée que sous forme inactive. Les gènes de structure d'une seconde composante dioxygénase ont été repérés dans un locus comportant deux autres gènes cataboliques. Les gènes pdoA2B2 codent pour une enzyme, appelée Pdo2, montrant une spécificité étroite vis-à-vis des HAP à 2 ou 3 cycles aromatiques et une nette préférence pour le phénanthrène. La protéine Pdo2 purifiée est un hexamère de type α3β3, possédant des centres [2Fe-2S] de type Rieske qui lui confèrent un spectre d'absorbance caractéristique. Des gènes susceptibles de coder pour une troisième dioxygénase ont été découverts dans le génome de Mycobacterium sp. 6PY1. Ces gènes sont très proches en séquence de ceux codant pour Pdo1, suggérant que la bactérie synthétise deux iso-enzymes capables d'oxyder le pyrène. Le fonctionnement des arène dioxygénases requiert deux protéines transporteurs d'électrons de type ferrédoxine et réductase. Celles qui sont associées aux enzymes Pdo1 et Pdo2 n'ont pas été identifiées. Cependant, l'activité des deux dioxygénases de la souche 6PY1 a été stimulée in vivo en co-exprimant dans E. coli des gènes accessoires recrutés d'autres bactéries. Enfin, des expériences d'immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques ont montré que les enzymes Pdo1 et Pdo2 sont co-induites en présence de HAP mais ne sont pas régulées de la même manière en fonction des conditions de croissance.