Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’objectif de cette thèse, dans le cadre de l'ANR TRICETOX (CESA, 2013-2017), était de développer des méthodes alternatives aux méthodes d’analyse chimiques classiques pour la détection spécifique des herbicides de la famille des β-tricétones. Ces nouveaux outils analytiques doiventt être faciles à utiliser, rapides, peu coûteux et devant répondre aux exigences imposées pour la détection de ces herbicides (valeur critique de 0,1 µg.L-1). Les β-tricétones ont pour cible spécifique l'enzyme p-HydroxyPhénylPyruvate Dioxygénase (HPPD), impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes, son inhibition entraîne un blanchiment des feuilles des plantes traitées. Deux stratégies ont été envisagées, basées sur l’inhibition de l’HPPD : un bio-essai colorimétrique à cellules entières utilisant un clone recombinant d'Escherichia coli exprimant l’HPPD d’Arabidopsis thaliana, et un biocapteur enzymatique à transduction électrochimique. Le principe du bio-essai repose sur la capacité du clone recombinant à produire un pigment brun à partir de la voie de catabolisme de la tyrosine. L’addition de β-tricétones entraîne une diminution de la pigmentation dans le milieu. Après optimisation des conditions opératoires, les LODs obtenues pour la mésotrione, la tembotrione, la sulcotrione et la leptospermone sont de 0,069, 0,051, 0,038 et 20 μM, respectivement. En format biocapteur, l'enzyme HPPD purifiée a été immobilisé sur la surface d’une électrode de graphite sérigraphiée. Le biocapteur à enzyme libre a permis l’obtention de limites de détection de 1,36-10 M, 1,25.10-11 M et 1,08.10-11 M pour la sulcotrione, la tembotrione et la mésotrione, respectivement. A ce jour, des échantillons réels ont été analysés sur le bio-essai et les résultats ont été validés par HPLC. / The goal of this thesis, in the frame of the ANR TRICETOX (CESA, 2013-2017), was to develop some alternative methods to conventional chromatographic methods for the monitoring of the β-triketone herbicides. These new analytical tools have to be easy to handle, fast, low-cost, and to respond to the requirements for the detection of these herbicides (critical value of 0.1 μg.L-1). The β-triketones specifically target the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) enzyme, involved in the carotenoids biosynthesis in plants ; its inhibition results in foliage bleaching of the treated plant. Two strategies have been considered, both based on the HPPD inhibition : a whole-cell colorimetric bioassay involving a recombinant E. coli expressing the HPPD from A. thaliana, and an electrochemical enzymatic biosensor. The principle of the bioassay is based on the ability of the recombinant E. coli clone to produce a soluble brown pigment from tyrosine catabolism. The addition of β-triketone induces the decrease of the pigment production in the medium. After optimization of the operational conditions, the LODs obtained for mesotrione, tembotrione, sulcotrione, and leptospermone were 0.069, 0.051, 0.038, and 20 μM, respectively. In the biosensor format, the purified HPPD enzyme was immobilized on the surface of a screen-printed graphite electrode. Using the free enzyme biosensor, LODs as low as 1.36-10 M, 1.25.10-11 M and 1.08.10-11 M were obtained for sulcotrione, mesotrione and tembotrione, respectively. Up to date, real samples have been analyzed using the bioassay and the results were validated by HPLC.

Le polyomavirus humain BK (virus BK) établit une infection persistante asymptomatique dans les voies rénales de 80% de la population humaine. Chez les patients transplantés, la réactivation du virus BK est à l'origine de néphropathies et de cystites hémorragiques. L'augmentation des pathologies associées au virus BK en même temps que l'utilisation de traitements immunosuppresseurs de plus en plus puissants souligne un lien étroit entre la réponse immunitaire de l'hôte et la réactivation virale. Cependant la réponse immune à l'infection par le virus BK, en particulier le rôle des cytokines antivirales dans le contrôle de l'infection est peu documentée. Ici, nous avons étudié l'efficacité antivirale des interférons (IFN) sur la multiplication du virus BK. Nous avons testé les IFN-alpha, lambda et gamma sur la souche Dunlop du virus BK dans les cellules Véro et MRC 5. L'IFN-gamma inhibe de façon dose-dépendante la transcription virale de la région précoce et de la région tardive ainsi que l'expression de la protéine virale VP1. Un moindre effet antiviral a été observé avec l'IFN-alpha et l'IFN lambda. Ces résultats sont associés à une phosphorylation prolongée de STAT 1 avec l'IFN-gamma, non retrouvée avec l'IFN-alpha et lambda. La différence d'efficacité entre ces trois types d'IFN suggère que certaines protéines induites seulement par l'IFN-gamma ont un effet antiviral dans l'infection par le virus BK. L'analyse transcriptionnelle révèle neuf protéines qui pourraient être impliquées dans cet effet antiviral spécifique. Parmi elles, nous avons étudié l'effet antiviral de l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) et les protéines de liaison au guanylate (GBP ou guanylate binding protéines), GBP1 et GBP2, sur le virus BK. Nos résultats montrent que GBP1 et GBP2 mais pas IDO contribuent à l'activité antivirale de l'IFN-gamma sur le virus BK. Trouver le mécanisme d'action de ces protéines antivirales induites par l'IFN pourrait nous aider à développer une stratégie thérapeutique / The human polyomavirus BK (BK virus) establishes an asymptomatic persistent infection in the urinary tract of 80% of the human population. In transplant recipients, reactivation of the BK virus infection is the cause of nephropathy and hemorrhagic cystitis. Diseases associated with BK virus infections are increasing at the same time as potent immunosuppressive therapies are developing. This highlights the importance of components of the immune system in controlling viral reactivation. However, the immune response to the BK virus, particularly the role of antiviral cytokines in infection control, is poorly documented. Here, we investigated the antiviral efficacy of interferons (IFN) on the BK virus multiplication. We tested IFN-alpha, lambda and gamma on the Dunlop strain of BK virus in Vero cells and MRC 5 cells. Treatment with IFN-gamma inhibited the expression of the viral protein VP1 in a dose dependent manner and decreased the expression of the early and late viral transcripts. A weaker antiviral effect was observed with IFN-alpha and IFN-lambda. These results are associated with a prolonged STAT1 phosphorylation with IFN-gamma but not with IFN-alpha and lambda. The difference of efficacy between these three types of interferon suggests that some interferon induced proteins only produced by IFN-gamma had an antiviral effect on BK virus infection. Transcriptomic analysis reveals that nine proteins could be involved in this specific antiviral effect. Among them, we selected and investigated the antiviral effect of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and guanylate binding protein 1 and 2 (GBP1 and GBP2) on the BK virus. Our results suggest that GBP1 and GBP2 but not IDO contribute to the antiviral activity of IFN-gamma on the BK virus. Finding the action mechanism of these IFN gamma induced antiviral proteins could help to develop a therapeutic strategy

Les HAP sont parmi les substances les plus problématiques parce qu'ils ont un fort pouvoir cancérigène, mutagène et ont, par conséquent, des effets nocifs pour la santé humaine. Parmi les techniques de remédiation des sols contaminés par des HAP, la phytoremédiation a été reconnue comme une méthode prometteuse en raison de ses avantages économiques et écologiques. Toutefois, en raison de la nature récalcitrante des HAP, et de facteurs environnementaux difficile à maîtriser, cette technique est encore limitée en termes d'efficacité, en particulier lorsqu'il s'agit de HAP de poids moléculaires élevés. L'inoculation des plantes avec des champignons mycorhiziens à arbuscules (MA), qui sont omniprésents dans la plupart des sols naturels et anthropiques, est connue pour favoriser l'élimination des HAP. Cependant, des résultats variables ont été rapportés quant à l'effet des plantes et des microorganisms associés notamment les champignons MA, sur la phytoremédiation des HAP et nécessite des études complémentaires. Des expériences été réalisées dans des cultures en pot et en microplaques, pour étudier l'influence de certains paramètres sur la dissipation des HAP dans la rhizosphère: l'espèce végétale, l'espèce fongique, la nutrition minérale, la nature des HAP, leur disponibilité et les interactions entre HAP. Quatre espèces de plantes (luzerne, fétuque élevée, ray-grass et céleri) et deux espèces de champignons MA (Glomus intraradices et Glomus mosseae) ont été testées dans un sol artificiellement contaminé avec trois HAP: le phénanthrène (PHE), le pyrène (PYR) et le dibenzo[a, h] anthracène (DBA). Le poids moléculaire des HAP est un facteur majeur influencant leur élimination. Lorsque le poids moléculaire des HAP était plus élevé, le nombre de bactéries dégradantes cultivables était plus faible, et l'efficacité de la phytoremédiation des HAP limitée. La présence de PHE a diminué la biomasse végétale et la colonisation mycorhizienne, mais il a augmenté la dissipation du DBA par co-métabolisme dans les expériences en pots et en microplaques. En revanche, cet effet n'a pas été observé entre le PYR et le DBA . La dissipation des HAP a varié avec les espèces de plantes et de champignons MA. Bien que les quatre espèces de plantes aient augmenté l'élimination du PHE, seule la luzerne a montré des effets positifs sur la phytoremédiation du DBA. Glomus intraradices a augmenté la biomasse végétale et l'absorption du phosphore par des plantes, et il a également augmenté la dissipation du DBA. Lorsque la co-culture de luzerne et fétuque était colonisée par Glomus mosseae, la biomasse obtenue était plus élevée, et la concentration des gènes de HAP-dioxygénase était significativement plus élevée qu'avec Glomus intraradices. Mais Glomus mosseae n'a montré aucun effet significatif sur la phytoremédiation du DBA. Ainsi cet effet des champignons MA sur la dissipation des HAP n'est pas seulement un effet biomasse. La concentration de phosphore et le régime d'alimentation en eau ont également influencé la colonisation mycorhizienne et la dissipation des HAP. Ainsi la dissipation du DBA en présence de plantes était significativement plus élevée que dans les témoins non plantés lorsque la teneur en eau était élevée et celle en phosphore plus faible, ce qui correspondait à la situation où le taux de mycorhization des plantes était le plus élevé. L'ensemble de ces résultats souligne la complexité des interactions entre plantes, microorganismes et polluants dans les sols. Ils montrent que tous les paramètres considérés affectent significativement la dissipation des HAP dans la rhizosphère des plantes, et méritent d'être pris en compte pour contrôler et améliorer la phytoremédiation / PAHs are among the most problematic substances as they could accumulate in the environment and threaten the development of living organisms because of their acute toxicity, mutagenicity or carcinogenity. Among remediation techniques for PAH contaminated sites, phytoremediation has been recognized as a promising method owing to its economical and ecological benefits. However, due to the recalcitrant nature of PAH, multivariate and changeful environment factors, this technique is still limited in terms of effectiveness, especially when dealing with high molecular weight PAHs. Inoculation of plants with arbuscular mycorrhizal (AM) fungi, which are ubiquitous in natural and most anthropogenically influenced soils, is known to benefit PAH phytoremediation. However, diverging results were reported on PAH dissipation in plant rhizosphere and the parameters affecting the AM fungi assisted PAH phytoremediation needed more investigation. Some of these parameters were considered in the present work: plant species, AM fungi species, phosphorus nutrition and watering regimes, PAH type, availability and interactions between PAHs. Experiments were performed in pot cultures and in microplates, with different plant species (including alfalfa, tall fescue, ryegrass and celery roots), two AM fungi (Glomus intraradices and Glomus mosseae) and three kinds of PAHs (phenanthrene (PHE), pyrene (PYR) and dibenzo[a,h]anthracene (DBA)), spiked to a soil. PAH molecular weight was a major parameter influencing PAH phytoremediation. With the increase of PAH molecular weight, the culturable PAH degraders decreased, so did the efficiency of phytoremediation. PHE decreased the plant biomass and AM fungi colonization, but it increased the DBA dissipation in both pot and microplate experiments. PYR did not increase DBA dissipation, and addition of PYR into PHE+DBA substrate decreased both PHE and DBA dissipation. PAH phytoremediation efficiency varied with the plant and AM fungi species. Although all four species of plants increased the disappearance of PHE, only alfalfa showed a positive effect on high molecular weight (HMW) PAHs. Glomus intraradices increased the plant biomass and phosphorus uptake of plants, and it also increased DBA dissipation in DBA or PHE+PYR+DBA spiked soil. Co-planted alfalfa and tall fescue colonized with Glomus mosseae obtained higher biomass and the concentration of the PAH-ring hydroxylating dioxygenase genes were significant higher, than with Glomus intraradices, but Glomus mosseae showed no or negative effect on DBA phytoremediation. The phosphorus concentration and water regime also influenced the AM fungus colonization and PAH dissipation. The highest AM colonization and a significant positive impact of mycorrhizal plants on the dissipation of DBA was detected in high-water and low-phosphorus treatment. Results indicated that complex interactions between plants, microorganisms and soil control the fate on PAHs. All the studied parameters significantly affected PAH dissipation in plant rhizosphere, and should be considered for controlling and improving phytoremediation efficiency

Les métalloprotéines contenant des centres Fe-S jouent un rôle important dans la<br />nature car elles sont impliquées dans des fonctions physiologiques essentielles telles que la<br />photosynthèse, la respiration et la fixation de l'azote.<br />Dans cette thèse, une ferrédoxine impliquée dans la biogenèse des centres Fe-S, et une<br />dioxygenase bactérienne jouant un rôle crucial dans la biodegradation des hydrocarbures<br />aromatiques ont fait l'objet d‘analyses structurales par cristallographie aux rayons X. La<br />structure d'une ferrédoxine de la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus, a été<br />résolue dans les états oxyde et réduit. De petits changements structuraux ont été observes lors de la réduction, notamment au voisinage du centre [2Fe-2S]. Ces changements sont compares a ceux décrits pour des ferrédoxines de structure similaire mais de fonction différente.<br />Une métalloprotéine plus complexe, appartenant a une grande famille de dioxygenases<br />bactériennes, a été étudiée pour son activité d'oxydation des hydrocarbures aromatiques<br />polycycliques (HAP). Cette enzyme a trois composantes, isolée d'une souche de<br />Sphingomonas dégradant les HAP comprend une oxydoréductase a NAD(P)H, une<br />ferrédoxine a centre [2Fe-2S], et composante oxygenase de six sous-unités assemblées en un hexamère de type α3β3. La composante oxygenase, appelée PhnI, contient une centre [2Fe-2S] de type Rieske et un ion ferreux par sous-unité α, qui ont été identifies par leur signature RPE. L'enzyme est douée d'une spécificité du substrat extrêmement large, puisqu'elle est capable d'hydroxyle toute une gamme de HAP fait de 2 a 5 cycles aromatiques, y compris des cancérogènes comme le benz[a]anthracene et le benzo[a]pyrene. Avec le naphtalène comme substrat, des mesures de cinétique ont montre que cette enzyme a un Km bas (0.92 WM) et une constante de spécificité de 2.0 WM-1. s-1. La proteine Phn1 a été cristallisée, et sa structure 3D a été résolue avec une résolution de 1.85 A. En dépit d'une modeste similitude de séquence avec des dioxygenases homologues, le repliement polypeptidique est très semblable.<br />Des différences ont toutefois été observées au niveau de la poche catalytique.<br />Les protéines sous forme cristallisée, notamment les protéines Fe-S, peuvent subir des<br />dommages dus au rayonnement X synchrotron, causant des artefacts lors de la détermination<br />de la structure. Pour essayer de palier cet inconvénient, des rayons X de très haute énergie (55 keV; 0.22 A), qui sont peu absorbes par les protéines, ont été utilises pour résoudre la<br />structure d'une proteine modèle, le lysozyme. Une structure a été établie pour la première fois<br />par cette approche, en utilisant les phases expérimentales obtenues par différentes méthodes.<br />Les applications potentielles en biologie structurale sont discutées.

L’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO) est une enzyme du catabolisme du tryptophane suspectée de jouer un double rôle lors des infections en contribuant aux défenses innées de l’hôte et en régulant la réponse immunitaire. IDO est exprimée au cours de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). Cependant, les mécanismes moléculaires conduisant à l’expression de IDO lors de l’hépatite C et l’impact de IDO sur la réplication virale et sur la réponse immunitaire ne sont pas connus. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que le VHC stimule l’expression de IDO dans les hépatocytes.L’expression de IDO était transitoire et coïncidait avec l’expression des interférons (IFNs) de types I et III et avec la transcription de gènes stimulés par les IFNs. L’expression de IDO était également augmentée dans les hépatocytes exposés à la présence de lymphocytes T CD4+ activés et producteurs d’IFN-γ. L’expression hépatique de IDO diminuait la réplication virale, ce qui suggère que IDO limite la diffusion du VHC dans le foie au cours de l’hépatite C. Grâce à des expériences de silencing, nous avons montré que IDO contribue à l’effet antiviral de l’IFN-α sur le VHC. L’expression de IDO était régulée par l’activation des facteurs de transcription IRF-1 et STAT-1 dans les hépatocytes infectés par le VHC. En plus de son effet antiviral sur le VHC, l’expression hépatique de IDO inhibait significativement la prolifération des lymphocytes T CD4+ activés, suggérant un rôle immunorégulateur de IDO au cours de l’hépatite C. Nos données suggèrent donc que IDO joue un double jeu lors de l’hépatite C, en limitant la réplication virale et en régulant la réponse immunitaire adaptative de l’hôte. Notre travail ouvre la voie à des expérimentations in vivo et à des études cliniques visant à préciser la place des inhibiteurs pharmacologiques de IDO dans l’arsenal thérapeutique contre le VHC. / Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) is a tryptophan-catabolizing enzyme that plays a dual role during infectious diseases by contributing to the innate defenses against pathogens and by regulating the immune response. IDO is expressed in patients with hepatitis C virus (HCV) infection. However, the molecular mechanism of IDO induction in HCV infection and its role in the antiviral immune response remain unknown. Using primary human hepatocytes, we have shown that HCV infection stimulates IDO expression. IDO gene induction was transient and coincided with the expression of type I and type III interferons (IFNs) and IFN-stimulated genes (ISGs) in HCV-infected hepatocytes. IDO expression was also stimulated when the hepatocytes were incubated with IFN-γ-secreting CD4+ T cells. Expression of IDO prior to HCV infection significantly impaired HCV replication in hepatocytes, suggesting that IDO limits the spread of HCV in the liver. By using siRNA-mediated IDO knockdown experiments, we have shown that IDO contributes to the IFN-α-antiviral effect on HCV replication. IDO expression was regulated by IRF-1 and STAT-1 in HCV-infected hepatocytes. Hepatic IDO expression also had a significant inhibitory effect on CD4+ T cell proliferation, suggesting an immunoregulatory role of IDO during HCV infection. Our data suggest that hepatic IDO plays a dual role during HCV infection by retarding viral replication and also regulating host immune responses. This work paves the way for in vivo experiments and clinical studies aiming to determine the relevance of pharmacological inhibition of IDO during HCV infection.

Les flavohémoglobines (FlavoHbs) sont des protéines fixant l’oxygène qui possèdent un domaine globine N-terminal lié de manière covalente à un domaine C-terminal réductase contenant une flavine adénine dinucléotide (FAD) et un site de fixation du nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate) (NAD(P)H). Ces protéines que l’on retrouve exclusivement chez les microorganismes possèdent une action NO dioxygénase et interviennent donc dans la défense des microorganismes contre les dommages générés par le NO. De par ce rôle essentiel de défense microbienne, les flavoHbs sont considérés comme des cibles attractives des antibiotiques. En particulier, les dérivés azolés ont montré la capacité d’inhiber la fonction NO dioxygénase des flavoHbs par un mécanisme inconnu. Afin de mieux comprendre le mode d’action de ces antibiotiques, nous avons entrepris une étude structurale, enzymatique et spectroscopique sur trois flavoHbs d’intérêt. Les structures tridimensionnelles de la flavoHb de R. eutropha (FHP) en complexe avec le miconazole, l’éconazole et le kétoconazole ainsi que celle de S. cerevisae (YHB) seule et en complexe avec l’éconazole ont été obtenues à des résolutions satisfaisantes permettant de décrire précisément les interactions entre la protéine et les inhibiteurs. Les structures ont révélé des réarrangements conformationnels importants selon la nature chimique de l’inhibiteur et la présence d’acides gras dans la poche de l’hème. Afin de comprendre le rôle fonctionnel des acides gras dans le cycle catalytique de l’enzyme, la structure tridimensionnelle de la FHP en complexe avec l’acide linolénique a été obtenue et des analyses enzymatiques et spectroscopiques ont montré l’importance des acides gras dans la modulation de l’activité de la protéine. Parallèlement, des études sur la FHP, la YHB et la flavoHb de S. aureus (Shb) ont permis de mieux appréhender le rôle des inhibiteurs dans le processus de transfert d’électrons au sein de la protéine. / Flavohemoglobins (FlavoHbs) are oxygen binding proteins which consist of a heme-globin domain fused with a ferredoxin reductase –like FAD and NAD-binding domain. FlavoHbs have been identified exclusively in microorganisms where they play a key role in defence against NO damages by using their NO dioxygenase activity. These proteins are therefore considered as targets for new antibiotic drugs. Recently, azole derivatives were proven to be attractive nitric oxide dioxygenase inhibitors by a mechanism that remains elusive. In order to explore their binding characteristics, we determined the X-ray structure of the flavoHb from Ralstonia eutropha in a complex with miconazole (FHPm), econazole (FHPe), and ketoconazole (FHPk) as well as the X- ray structure of S. cerevisae flavoHb in both ligand-free and econazole-bound forms. We describe the interactions between the protein matrix and the inhibitors in a comparative manner and how the bulky structures of the azole inhibitors dictate the profile of the hemebinding pocket and vice versa in flavoHbs.Although the azole compounds were able to push the lipid out of its binding site, a fatty acid fragment is still bound inside the heme pocket of FHPe and FHPk and dictates the state of the protein. To go further in the compréhension of the fatty acid function in the flavoHbs, we determined the three dimensionnal structure of FHP in complex with linolenic acid. Spectroscopic and enzymatic analyzis confirmed the important role of fatty acids in enhancing the protein activity. We also made studies to understand how azoles modulate the electron transfer process in the flavoHbs.

Cette thèse traite de la biodégradation par les bactéries d'une catégorie de polluants appelés hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP. La bactérie Mycobacterium sp. 6PY1 a été isolée d'un sol pollué pour sa capacité à utiliser un HAP à 4 cycles, le pyrène, comme seule source de carbone et d'énergie. Pour comprendre comment le pyrène est métabolisé, l'identification des enzymes impliquées a été entreprise par une approche protéomique. Cette approche a notamment mis en évidence dans la souche 6PY1 deux arène dioxygénases, enzymes susceptibles de catalyser l'attaque initiale du pyrène. L'objectif de cette étude consistait à cloner les gènes de structure des arène dioxygénases identifiées chez Mycobacterium 6PY1, à surexprimer ces gènes en système hétérologue pour faciliter la purification des enzymes correspondantes, et à déterminer les propriétés biochimiques et catalytiques de ces enzymes. Les gènes pdoA1B1 codant la composante terminale d'une dioxygénase ont été clonés et surexprimés chez E. coli. Les propriétés catalytiques de cette enzyme, appelée Pdo1, ont été déterminées in vivo en dosant les produits d'oxydation de HAP composés de 2 à 4 cycles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). L'analyse de la sélectivité de l'enzyme, déterminée de cette façon montre que Pdo1 oxyde préférentiellement des HAP à 3 ou 4 cycles, comme le phénanthrène et le pyrène, mais n'attaque pas les di-aromatiques comme le naphtalène et le biphényle. La protéine Pdo1 s'est révélée instable et n'a été purifiée que sous forme inactive. Les gènes de structure d'une seconde composante dioxygénase ont été repérés dans un locus comportant deux autres gènes cataboliques. Les gènes pdoA2B2 codent pour une enzyme, appelée Pdo2, montrant une spécificité étroite vis-à-vis des HAP à 2 ou 3 cycles aromatiques et une nette préférence pour le phénanthrène. La protéine Pdo2 purifiée est un hexamère de type α3β3, possédant des centres [2Fe-2S] de type Rieske qui lui confèrent un spectre d'absorbance caractéristique. Des gènes susceptibles de coder pour une troisième dioxygénase ont été découverts dans le génome de Mycobacterium sp. 6PY1. Ces gènes sont très proches en séquence de ceux codant pour Pdo1, suggérant que la bactérie synthétise deux iso-enzymes capables d'oxyder le pyrène. Le fonctionnement des arène dioxygénases requiert deux protéines transporteurs d'électrons de type ferrédoxine et réductase. Celles qui sont associées aux enzymes Pdo1 et Pdo2 n'ont pas été identifiées. Cependant, l'activité des deux dioxygénases de la souche 6PY1 a été stimulée in vivo en co-exprimant dans E. coli des gènes accessoires recrutés d'autres bactéries. Enfin, des expériences d'immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques ont montré que les enzymes Pdo1 et Pdo2 sont co-induites en présence de HAP mais ne sont pas régulées de la même manière en fonction des conditions de croissance.

L’usage répété d’isoproturon (IPU) en agriculture pour contrôler développement de plantes adventices dans les cultures céréalières a non seulement abouti à la contamination du sol et des ressources en eaux mais également à l’adaptation de la microflore du sol à la dégradation accélérée de cet herbicide appartenant à la famille des phénylurées. A l’heure actuelle, les mécanismes microbiens impliqués dans cette adaptation ne sont pas encore parfaitement élucidés. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude était d’explorer les processus et les facteurs impliqués dans la biodégradation de l’isoproturon, et ce, depuis l’échelle agricole de la parcelle jusqu’à celle des gènes codant cette fonction dans des populations microbienne dégradantes.L’étude réalisée à partir d’une parcelle expérimentale du domaine d’Epoisses, cultivée selon une rotation blé d’hiver/ orge / colza, a montré que, suite à l’usage répété d’IPU, la microflore du sol s’était adaptée à sa minéralisation. Des analyses réalisées à l’aide d’outils statistiques et géostatistiques ont révélé l’existence d’une variabilité spatiale de la minéralisation de l’IPU au sein de la parcelle agricole. Celle-ci s’est révélée être non seulement corrélée avec différents caractéristiques physicochimiques du sol (C/N, CEC, …) mais également avec le plan d’épandage des pesticides au cours de la rotation culturale.Afin de mieux étudier les mécanismes moléculaires responsables de la minéralisation de l’IPU, une culture bactérienne ainsi qu’une souche (Sphingomonas sp. SH) minéralisant l’IPU ont été isolées par enrichissement à partir de deux sols différents, tous deux adaptés à la biodégradation accélérée de l’IPU. La culture bactérienne et la souche pure ont toutes deux montré un métabolisme spécifique pour la dégradation de l’IPU, étant capables de dégrader l’IPU et ses principaux métabolites mais aucun des autres herbicides de la famille des phénylurées. La culture bactérienne et la souche présentaient une activité dégradante optimale à pH7,5 et étaient affectées par des pH inférieurs et supérieurs à cette valeur optimale. Sur la base des métabolites accumulés lors de la dégradation de l’IPU, nous avons proposé que l’IPU serait dégradé par deux déméthylations successives, suivi par la coupure de la chaine urée aboutissant à l’accumulation de 4-isopropylaniline, et finalement la minéralisation du cycle phényl.Afin d’identifier les gènes impliqués dans la minéralisation de l’IPU, une banque de clones BAC a été réalisée à partir de l’ADN génomique purifié de la culture bactérienne. Bien que le crible fonctionnel réalisé n’a pas permis d’identifier de BAC capable de dégrader l’IPU ou l’un de ses métabolites, un criblage moléculaire par PCR ciblant la séquence catA codant la catéchol 1,2-dioxygénase, nous a permis d’identifier trois BACs. Le pyroséquençage des ces 3 BACs et l’agrégation des séquences correspondantes ont permis d’identifier un fragment génomique de 33 kb présentant notamment l’opéron cat impliqué dans le clivage ortho du cycle phényl du catéchol. De ce fait nous avons émis l’hypothèse selon laquelle la 4-isopropylaniline formée lors de la dégradation de l’IPU pourrait être minéralisée par le clivage ortho du catéchol, un intermédiaire clef de la voie des beta-kétoadipates. Ceci nous a donc permis de proposer une voie métabolique pour la voie basse de la dégradation de l’IPU qui, jusqu’alors, n’avait pas encore été décrite. / Frequent use of phenylurea herbicide isoproturon (IPU) in agricultural fields has resulted not only in the contamination of the natural resources including soil and water but also in the adaptation of the soil microflora to its rapid degradation. However, up to now, the mechanisms underlying this microbial adaptation are not well elucidated. The aim of this study was to explore the processes and factors implicated in IPU degradation from the agricultural field to the genes coding for catabolic genes. The study carried out at the experimental field of Epoisses cropped with a winter wheat / barley / rape seed crop rotation indicated that as a result of its periodically repeated use, the soil microflora adapted to IPU mineralization activity. Further analysis using exploratory and geostatistical tools demonstrated the existence of spatial variability in IPU mineralization activity at the field scale which was correlated not only with several soil physico-chemical parameters like organic matter content, CEC and C/N ratio but also with the pesticide application plan over a three year crop rotation. In order to get further insight into underlying mechanisms, an IPU mineralizing bacterial culture and strain Sphingomonas sp. SH were isolated through enrichment cultures performed from two different adapted soils. Both had the catabolic activities highly specific for the mineralization of IPU and its metabolites but none of other structurally related phenylurea herbicides. IPU metabolic activity of both the mixed culture and the strain SH was found to be affected by pH with optimal activity taking place at pH 7.5. Based on the accumulation of different known metabolites during mineralization kinetics, IPU metabolic pathway was proposed to be initiated by two successive demethylations, followed by cleavage of the urea side chain resulting in the accumulation of 4-isopropylaniline, and ultimately the mineralization of the phenyl ring. In order to identify the genes involved in IPU degradation, BAC clone library was established from the genomic DNA of the bacterial culture. Although, the functional screening did not yield in identifying any BAC clone able to degrade IPU or its known metabolites, the PCR based screening led us to identify a cat gene cluster involved in ortho-cleavage of the phenyl ring of catechol through beta-ketoadipate pathway. Based on this finding, it was hypothesized that phenyl ring of 4-isopropylaniline formed during IPU transformation might be mineralized through ortho-cleavage of catechol. This finding allowed us to propose the lower IPU metabolic pathway which was not yet described.