Candida tropicalis yeast is a microorganism that possesses high tolerance for phenol and strong phenol degrading activity. This yeast is capable of utilizing phenol as the sole source of carbon and energy without formation of any secondary waste product. Catechol-1,2- dioxygenase was isolated from cytosolic fraction of this yeast by the procedure consisting of chromatography on DEAE-Sepharose and gel permeation chromatography on Sephadex G- 100. The catechol-1,2-dioxygenase was purified to homogeneity. The enzyme activity was followed by HPLC (catechol consumption and/or cis,cis-muconic acid formation). The activity profiles at different temperatures showed temperature optimum of 30řC. Kinetic characterizations were studying in different values of pH. The values of Km and Vmax of 0,52 mM and 17,2 nM/min for consumption of catechol, respectively, and 0,34 mM and 12,6 nM/min for formation of cis,cis-muconic acid, respectively, were found at optimum pH of the reaction, pH 7,6.

O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato). / The use of chlorinated compounds bearing aromatic structures in their chemical composition has quickly grown in the last few years due to their general presence in processes of modern industry. The degradation of such compounds is slow, due to their high chemical stability, thus making them frequent polutants of the environment. Different strategies to tackle this problem are available. The so-called bioremediation methods are among those strategies and have been gaining many applications because of their higher efficiency and due to the use of enzymes, which do not affect the environment, to perform the degradation task. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida is one of those enzymes and is the object of study of this project. Our group has been working on understanding the mechanism of action of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida since we believe that a more efficient use of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida necessarily involves knowledge about ways of controlling the enzymatic activity. Thus, our results consisted in the optimization of the expression and purification protocols that allow the production of pure protein in high yields after changing its expression vector. Assays of enzyme activity with different substrates and development of a protocol for kinetic characterization was also done to assess the existence of mechanisms of inhibition/modulation of the reaction by the substrate and/or product. Analysis of the secondary structure by circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism was also performed to assess the integrity of the new construction. Tests were also carried out to separate the amphipatic ligands present in the Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida structure for analysis in a mass spectrometer in order to identify which kind of amphipathic molecule may be present in enzyme hydrophobic site. Finally, lipid-protein interactions were investigated by means of differential scanning calorimetry, electron paramagnetic resonance and circular dichroism. The results indicated a potential interaction with model membranes, especially in the presence of PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate).

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.

O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato). / The use of chlorinated compounds bearing aromatic structures in their chemical composition has quickly grown in the last few years due to their general presence in processes of modern industry. The degradation of such compounds is slow, due to their high chemical stability, thus making them frequent polutants of the environment. Different strategies to tackle this problem are available. The so-called bioremediation methods are among those strategies and have been gaining many applications because of their higher efficiency and due to the use of enzymes, which do not affect the environment, to perform the degradation task. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida is one of those enzymes and is the object of study of this project. Our group has been working on understanding the mechanism of action of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida since we believe that a more efficient use of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida necessarily involves knowledge about ways of controlling the enzymatic activity. Thus, our results consisted in the optimization of the expression and purification protocols that allow the production of pure protein in high yields after changing its expression vector. Assays of enzyme activity with different substrates and development of a protocol for kinetic characterization was also done to assess the existence of mechanisms of inhibition/modulation of the reaction by the substrate and/or product. Analysis of the secondary structure by circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism was also performed to assess the integrity of the new construction. Tests were also carried out to separate the amphipatic ligands present in the Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida structure for analysis in a mass spectrometer in order to identify which kind of amphipathic molecule may be present in enzyme hydrophobic site. Finally, lipid-protein interactions were investigated by means of differential scanning calorimetry, electron paramagnetic resonance and circular dichroism. The results indicated a potential interaction with model membranes, especially in the presence of PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate).

Submitted by orjuela@ibilce.unesp.br (orjuela@ibilce.unesp.br) on 2016-02-17T12:16:38Z No. of bitstreams: 1 Isolamento de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos aromáticos 1-107.pdf: 3940758 bytes, checksum: c39dfe1dada0d918848470d3f0de5b83 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-02-17T13:16:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 orjuela_gl_dr_rcla.pdf: 3940758 bytes, checksum: c39dfe1dada0d918848470d3f0de5b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-17T13:16:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 orjuela_gl_dr_rcla.pdf: 3940758 bytes, checksum: c39dfe1dada0d918848470d3f0de5b83 (MD5) Previous issue date: 2016-02-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Este documento foi organizado em dois capítulos. O Capítulo I é um artigo de revisão intitulado “Metabolic Pathways for Aromatic Compounds Degradation by Bacteria”, no qual são descritas as fontes naturais e antrópicas dos hidrocarbonetos aromáticos e suas características químicas. Relacionaram-se os fatores ambientais que afetam a degradação aeróbia e anaeróbia desses compostos por bactérias e os principais compostos intermediários produzidos. É descrita passo a passo a sequência de preparação e desaromatização do anel benzênico e os compostos finais dessa degradação. O artigo foi publicado no volume 237 da série Reviews of Environmental Contamination and Toxicology em janeiro de 2016 (Springer http://dx.doi.org/10.1007/978-3-319-23573-8_5). O Capítulo II contém os resultados da pesquisa desenvolvida. O objetivo geral foi isolar cepas bacterianas de amostras de solo e avaliar o potencial degradador de fenol e outros hidrocarbonetos aromáticos. Foram realizadas coletas de amostras de solo de cinco postos de combustíveis, para a seleção das cepas bacterianas e para análises químicas e granulométricas. Alíquotas das amostras de solo foram transferidas para meio de cultura seletivo contendo querosene como única fonte de carbono. Testes morfológicos e bioquímicos indicaram que as cepas isoladas são Gram negativas, móveis, catalase positivas, produtoras de cápsula e de biossurfactantes. O sequenciamento do gene 16S rRNA mostrou 99 a 100% de similaridade com o gênero Pseudomonas sp. Todas as cepas degradaram o fenol em concentração de 120 mg L-1 em menos de 24 horas. Testes da atividade enzimática mostraram que algumas das cepas expressaram a catecol 1,2-dioxigenase que catalisa a orto-clivagem do anel benzênico e outras expressaram a catecol 2,3 dioxigenase da meta-clivagem do anel aromático. Uma cepa não apresentou atividade para nenhuma dessas duas enzimas e uma apresentou atividade de ambas. Todas as cepas foram capazes de crescer em presença de fenantreno, fluoranteno e pireno. / This document is organized in two chapters. The Chapter I is a review paper entitled “Metabolic Pathways for Aromatic Compounds Degradation by Bacteria” in which are described natural and anthropogenic sources of aromatic hydrocarbons and their chemical characteristics. There are listed environmental factors that affect the aerobic and anaerobic degradation by bacteria and the central intermediates yielded. It is described step to step of sequence of preparation and dearomatization of benzene ring and the final metabolites of breakdown. The manuscript was publicated in the volume 237 of Reviews of Environmental Contamination and Toxicology in January of 2016 (Springer http://dx.doi.org/10.1007/978-3- 319-23573-8_5). Chapter II has the results of developed research. The general objective was to isolate bacterial strains from samples of soil and to evaluate the potential of them for breakdown hydrocarbons. Soil samples from five gas stations were collected to isolate the bacterial strains and chemical and granulometric analysis was made. Aliquots of the soil samples were cultured with selective media with kerosene as only carbon and energy sources. Morphological and biochemical tests showed that bacterial strains were Gram negatives, motile, positive catalase, capsule-producers and biosurfactant producers. The sequencing of 16S rRNA gene showed 99 to 100% similarity with Pseudomonas sp genera. All bacterial strains were able to degrade phenol 120 mg L-1 in less than 24 hours. Tests of enzymatic activity showed that some bacteria expressed the catecol 1,2-dioxygenase that catalyze ortoclivage of benzene ring, others showed activity for the catecol 2,3-dioxygenase that catalyze the meta-cleavage of the ring. One strain did not show activity for any of these enzymes and one strain had activity for both. All strains were able to growth with fenantrene, fluoranthene and pyrene. / CNPq: 140704/2012-4

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.

L’usage répété d’isoproturon (IPU) en agriculture pour contrôler développement de plantes adventices dans les cultures céréalières a non seulement abouti à la contamination du sol et des ressources en eaux mais également à l’adaptation de la microflore du sol à la dégradation accélérée de cet herbicide appartenant à la famille des phénylurées. A l’heure actuelle, les mécanismes microbiens impliqués dans cette adaptation ne sont pas encore parfaitement élucidés. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude était d’explorer les processus et les facteurs impliqués dans la biodégradation de l’isoproturon, et ce, depuis l’échelle agricole de la parcelle jusqu’à celle des gènes codant cette fonction dans des populations microbienne dégradantes.L’étude réalisée à partir d’une parcelle expérimentale du domaine d’Epoisses, cultivée selon une rotation blé d’hiver/ orge / colza, a montré que, suite à l’usage répété d’IPU, la microflore du sol s’était adaptée à sa minéralisation. Des analyses réalisées à l’aide d’outils statistiques et géostatistiques ont révélé l’existence d’une variabilité spatiale de la minéralisation de l’IPU au sein de la parcelle agricole. Celle-ci s’est révélée être non seulement corrélée avec différents caractéristiques physicochimiques du sol (C/N, CEC, …) mais également avec le plan d’épandage des pesticides au cours de la rotation culturale.Afin de mieux étudier les mécanismes moléculaires responsables de la minéralisation de l’IPU, une culture bactérienne ainsi qu’une souche (Sphingomonas sp. SH) minéralisant l’IPU ont été isolées par enrichissement à partir de deux sols différents, tous deux adaptés à la biodégradation accélérée de l’IPU. La culture bactérienne et la souche pure ont toutes deux montré un métabolisme spécifique pour la dégradation de l’IPU, étant capables de dégrader l’IPU et ses principaux métabolites mais aucun des autres herbicides de la famille des phénylurées. La culture bactérienne et la souche présentaient une activité dégradante optimale à pH7,5 et étaient affectées par des pH inférieurs et supérieurs à cette valeur optimale. Sur la base des métabolites accumulés lors de la dégradation de l’IPU, nous avons proposé que l’IPU serait dégradé par deux déméthylations successives, suivi par la coupure de la chaine urée aboutissant à l’accumulation de 4-isopropylaniline, et finalement la minéralisation du cycle phényl.Afin d’identifier les gènes impliqués dans la minéralisation de l’IPU, une banque de clones BAC a été réalisée à partir de l’ADN génomique purifié de la culture bactérienne. Bien que le crible fonctionnel réalisé n’a pas permis d’identifier de BAC capable de dégrader l’IPU ou l’un de ses métabolites, un criblage moléculaire par PCR ciblant la séquence catA codant la catéchol 1,2-dioxygénase, nous a permis d’identifier trois BACs. Le pyroséquençage des ces 3 BACs et l’agrégation des séquences correspondantes ont permis d’identifier un fragment génomique de 33 kb présentant notamment l’opéron cat impliqué dans le clivage ortho du cycle phényl du catéchol. De ce fait nous avons émis l’hypothèse selon laquelle la 4-isopropylaniline formée lors de la dégradation de l’IPU pourrait être minéralisée par le clivage ortho du catéchol, un intermédiaire clef de la voie des beta-kétoadipates. Ceci nous a donc permis de proposer une voie métabolique pour la voie basse de la dégradation de l’IPU qui, jusqu’alors, n’avait pas encore été décrite. / Frequent use of phenylurea herbicide isoproturon (IPU) in agricultural fields has resulted not only in the contamination of the natural resources including soil and water but also in the adaptation of the soil microflora to its rapid degradation. However, up to now, the mechanisms underlying this microbial adaptation are not well elucidated. The aim of this study was to explore the processes and factors implicated in IPU degradation from the agricultural field to the genes coding for catabolic genes. The study carried out at the experimental field of Epoisses cropped with a winter wheat / barley / rape seed crop rotation indicated that as a result of its periodically repeated use, the soil microflora adapted to IPU mineralization activity. Further analysis using exploratory and geostatistical tools demonstrated the existence of spatial variability in IPU mineralization activity at the field scale which was correlated not only with several soil physico-chemical parameters like organic matter content, CEC and C/N ratio but also with the pesticide application plan over a three year crop rotation. In order to get further insight into underlying mechanisms, an IPU mineralizing bacterial culture and strain Sphingomonas sp. SH were isolated through enrichment cultures performed from two different adapted soils. Both had the catabolic activities highly specific for the mineralization of IPU and its metabolites but none of other structurally related phenylurea herbicides. IPU metabolic activity of both the mixed culture and the strain SH was found to be affected by pH with optimal activity taking place at pH 7.5. Based on the accumulation of different known metabolites during mineralization kinetics, IPU metabolic pathway was proposed to be initiated by two successive demethylations, followed by cleavage of the urea side chain resulting in the accumulation of 4-isopropylaniline, and ultimately the mineralization of the phenyl ring. In order to identify the genes involved in IPU degradation, BAC clone library was established from the genomic DNA of the bacterial culture. Although, the functional screening did not yield in identifying any BAC clone able to degrade IPU or its known metabolites, the PCR based screening led us to identify a cat gene cluster involved in ortho-cleavage of the phenyl ring of catechol through beta-ketoadipate pathway. Based on this finding, it was hypothesized that phenyl ring of 4-isopropylaniline formed during IPU transformation might be mineralized through ortho-cleavage of catechol. This finding allowed us to propose the lower IPU metabolic pathway which was not yet described.

Effluents of industrial wastewaters from oil refineries, paper mills, dyes, ceramic factories, resins, textiles and plastic contain high concentrations of aromatic compounds, which are toxic to organisms. Degradation of these compounds to tolerant limits before releasing them into the environment is an urgent requirement. Candida tropicalis yeast is an important representative of eucaryotic microorganisms that are able to utilize phenol. During the first phase of phenol biodegradation, cytoplasmatic NADPH-dependent phenol hydroxylase of C. tropicatis oxidizes phenol to catechol. Catechol is in the second phase of biodegradative process oxidized to cis,cis-muconic acid by the reaction catalyzed with catechol-1,2-dioxygenase. In this diploma thesis we investigated the effect of the heavy metal ions on NADPH-dependent phenol hydroxylase and catechol-1,2-dioxygenase of C. tropicalis. Phenol hydroxylase was inhibited by Cu2+ and Pb2+ ions. Catechol dioxygenase was inhibited by all substances containing heavy metal ions (Fe2+ , Mn2+ , Cd2+ , Cu2+ and Pb2+ ), which were tested in this work. The most effective inhibition was produced by Pb2+ followed by Mn2+ , Cd2+ Fe2+ and Cu2+ ions. The higher sensitivity of catechol-1,2-dioxygenase to heavy metal ions might follow from the presence of histidine residue...