Objetivos: La evidencia sugiere que la microbiota podría contribuir a la patogénesis de una serie de enfermedades, incluido el cáncer, habiéndose propuesto distintos mecanismos que demuestran la influencia de la microbiota en el proceso de la carcinogénesis. En el cáncer de vejiga, estudios preliminares han encontrado alteraciones en la microbiota urinaria de pacientes con carcinoma urotelial en comparación con individuos sanos. El objetivo del estudio fue caracterizar, mediante técnicas de secuenciación masiva, la microbiota de la vejiga en muestras de mucosa tumoral y mucosa pareada no tumoral procedentes de una cohorte de pacientes con neoplasia maligna de vejiga, además de estudiar las diferencias en la composición microbiana de la mucosa tumoral según las variables clínico-patológicas y determinar posibles perfiles microbianos. Material y métodos: Se analizaron un total de 58 muestras de 32 pacientes con cáncer de vejiga (26 pacientes con muestras pareadas [tejido tumoral y no tumoral] y 6 pacientes con muestras tumorales). Se extrajo el ADN bacteriano del tejido congelado a -80ºC en el Biobanco del HGU de Elche, mediante QIAamp DNA mini kit (Qiagen). Para la construcción de las librerías de amplicones se amplificó un fragmento de 459 pares de bases correspondiente a las regiones variables V3 y V4 del gen ADNr, utilizando los cebadores descritos para metagenomas humanos a los cuales se les añadió la secuencia de los adaptadores de Illumina. Se secuenciaron las muestras mediante la opción de lecturas emparejadas de 2x300pb con MiSeq Reagent Kit v3 de 300 ciclos. En el análisis de secuencias, se realizó un control de calidad mediante el programa prinseq, se unieron las lecturas R1 y R2 procedentes de la secuenciación mediante el programa flash y se eliminaron las eventuales secuencias quiméricas mediante el programa usearch. Las secuencias resultantes se utilizaron para su clasificación empleando la base de datos Ribosomal Database Project. Para el análisis estadístico se utilizó el software R versión 3.5.2. Tanto los estimadores de riqueza específica y abundancia relativa, como el número de filos y géneros bacterianos encontrados en los grupos de estudio se compararon mediante el test de wilcoxon y el test U-Mann-Whitney en los análisis de muestras pareadas y no pareadas, respectivamente. Se realizó un análisis multivariante de Componentes Principales bidimensional entre grupos y un test PERMANOVA para buscar diferencias significativas en la composición microbiana en función de las variables clínico-patológicas. Las diferencias intergrupales se analizaron mediante el método de análisis discriminante efecto-tamaño (LDA effect size, LEfSe). Por último, se realizó un Heatmap para identificar distintos clusters en la composición microbiana. Los clusters encontrados se correlacionaron con las variables tumorales mediante el test de chi-cuadrado o test de Fisher. Resultados: Encontramos diferencias significativas en los índices de riqueza específica OBS (p=0,012) y Chao2 (p=0,049) a nivel de género, siendo mayores en la mucosa no tumoral respecto a la mucosa tumoral. En cuanto a los índices de abundancia relativa no hubo diferencias significativas entre ambos grupos. Nuestros resultados muestran que el filo más abundante en ambos grupos fue Firmicutes, seguido de Bacteroidetes, Proteobacteria y Actinobacteria. Y que las Actinobacterias se encontraban significativamente más enriquecidas en la mucosa no tumoral respecto a la mucosa tumoral (p-valor = 0,009). Los géneros más abundantes en ambos grupos fueron Bacteroides y Escherichia.Shigella, seguido de Staphylococcus y Enterococcus en la mucosa tumoral, y Phascolarctobacterium y Propionibacterium en la mucosa no tumoral. No encontramos diferencias significativas en la composición microbiana a nivel de género. En el análisis multivariante, tanto a nivel de filo como de género, encontramos diferencias significativas en la composición microbiana en función del grado de tumor (p-valor = 0,03 y 0,04, respectivamente). La mucosa de los pacientes con bajo grado de tumor presentaba un mayor enriquecimiento del género Enterococcus respecto a los pacientes con alto grado de tumor. Para finalizar, se identificó la presencia de tres clusters en la composición microbiana de las muestras de mucosa tumoral. El cluster 1 se encontraba significativamente enriquecido de los géneros Barnesiella, Parabacteroides, Prevotella, Alistipes y Lachnospiracea_incertae_sedis, mientras que el cluster 2 de Staphylococcus. No se encontraron diferencias significativas al correlacionar los diferentes clusters con las variables clínicopatológicas, ni en el análisis de supervivencia. Conclusiones: Encontramos una mayor riqueza microbiana de los tejidos no tumorales respecto a los tejidos tumorales que coincide con la asunción global de que la riqueza es un indicador de salud de la microbiota. La mayor abundancia del filo Actinobacteria en las muestras de mucosa de vejiga no neoplásica respecto al tejido tumoral, refuerza la hipótesis inicialmente planteada de que una microbiota rica en Actinomycetes podría estar relacionada con la menor incidencia de cáncer de vejiga en las mujeres y por tanto, podría tener un efecto preventivo. El análisis multivariante de la composición microbiana del tejido tumoral reveló diferencias significativas en función del grado del tumor, encontrándose en los tumores de bajo grado, un perfil microbiano enriquecido por bacterias del género Enterococcus. Finalmente, se identificaron tres perfiles microbianos diferentes, encontrando diferencias significativas en dos ellos; mientras que el cluster 1 presentaba una microbiota enriquecida por el filo Bacteroidetes, el cluster 2 estaba más enriquecido por el filo Firmicutes. Se necesitan estudios prospectivos longitudinales que permitan establecer la relación causal de la microbiota en el proceso de carcinogénesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:ua.es/oai:rua.ua.es:10045/111292 |
| Date | 28 July 2020 |
| Creators | Parra Grande, Mónica |
| Contributors | Sanchez-Hellin, Victoria, Universidad de Alicante. Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología |
| Publisher | Universidad de Alicante |
| Source Sets | Universidad de Alicante |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Rights | Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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