Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du
Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale
causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en
Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte
les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années,
plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent
rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées
potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien
documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la
sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes
respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un
activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation
soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite
à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le
cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques
et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de
considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une
caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et
structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de
différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de
déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les
mécanismes.
Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de
quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage
des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03,
la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats
suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un
effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice
indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les
effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette
v
molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets
inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que
cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la
présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le
CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire
indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi
que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions
sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des
expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont
indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état
d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son
action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant
un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis
d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ
et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la
base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR,
aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du
canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De
plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1
pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur
l’interaction CaM-KCa3.1.
Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos
résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il
est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du
VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des
potentiateurs moins efficaces. / Airway epithelial cells are the site of Cl- secretion through CFTR. Cystic
fibrosis is a fatal genetic disease caused by mutations in CFTR. The most
frequent mutation in North America (∆F508) results in impaired maturation and
altered channel gating of the protein. In the last years, several small molecules
were identified by high throughput screening that could restore mutated CFTR
function. Compounds addressing CFTR gating defects are referred to as
potentiators. The basolateral K+ channel KCa3.1 has been documented to play
a prominent role in establishing a suitable driving force for CFTR-mediated Clsecretion
in airway epithelial cells. It has been shown, for example, that the
application of 1-EBIO on T84 monolayers results in a sustained increase of Clsecretion
and that this current can be reversed by application of CTX, a KCa3.1
inhibitor (Devor et al., 1996). Thus, in a global approach of transepithelial
transport, the research for physiologically relevant CFTR potentiators should
also consider their effects on the KCa3.1 channel. Electrophysiological patch
clamp measurements and channel structural modification by site directed
mutagenesis were used to characterize the action of CFTR potentiators on
KCa3.1 and study their molecular mode of action.
In this work we present results on the effects on KCa3.1 of several
CFTR potentiators of different structures. We observed that the CFTR
potentiators genistein, curcumin, SF-03 and VRT-532 could inhibit KCa3.1
activity at concentrations known to activate CFTR. Our results suggest that SF-
03 could act indirectly on KCa3.1 through a mechanism involving an accessory
protein. Curcumin would also have an indirect inhibitory effect, probably
mediated by the plasma membrane, as documented for other ion channels. A
detailed study of VRT-532 revealed that this molecule has access to its binding
site in a state independent manner, and is poorly effective on the V282G
mutant of KCa3.1, which is constitutively active. These results suggest that
VRT-532 could act through the CaM/KCa3.1 complex and require the presence
of Ca2+ to inhibit channel activity. In contrast, CBIQ, another CFTR potentiator,
succeeded to activate KCa3.1. Our results in single channel show that CBIQ
vii
destabilizes a non conducting state of the channel. We also showed that this
molecule increases the apparent Ca2+ affinity as well as the channel open
probability, even in saturating Ca2+ conditions. Experiences in which Ba2+ was
used as a probe were also performed to determine if the action mechanism of
CBIQ involves an effect on the selectivity filter. Our results showed that Ba2+
could displace CBIQ from its interacting site, suggesting that the increases in
channel activity induced by CBIQ could result from a change in the energetics
of the channel at the level of the selectivity filter. On the basis of our results, we
conclude that CBIQ, a CFTR potentiator, could activate KCa3.1 by destabilizing
a non conducting state of the channel, probably through an action near the
selectivity filter region. Also, CFTR potentiators having an inhibitory effect on
KCa3.1 are likely to act through the plasmic membrane, the CaM/KCa3.1
interaction or an accessory protein of the channel.
In a perspective of future treatments for CF, our results indicate that
CBIQ could be an efficient potentiator since this product stimulates KCa3.1 as
well as CFTR. Conversly, the VRT-532 and SF-03 could be less efficient than
on CFTR alone, due to their inhibition of KCa3.1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/4054 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Longpré-Lauzon, Ariane |
| Contributors | Sauvé, Rémy |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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