La fibrose kystique (FK) est la maladie génétique mortelle la plus répandue chez les jeunes Canadiens. La colonisation des poumons par une bactérie opportuniste, Pseudomonas aeruginosa, est la principale cause de morbidité et de mortalité chez les patients FK. La maladie est causée par des mutations du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) qui agit comme canal à ions chlorures. Ces modifications entraînent notamment une surexpression d'oligosaccharides fucosylés à la surface de l'épithélium pulmonaire. Le processus d'adhésion de la bactérie à la surface des cellules de l'épithélium pulmonaire est causé par la présence de deux lectines à la surface de la bactérie. Nous nous intéressons principalement à l'une d'entre elles, une lectine calcium dépendante qui reconnaît particulièrement le L-fucose (PA-IlL). Des études cristallographiques menées sur PA-IlL, en complexe avec divers ligands naturels tel que le Lewis a, ont permis d'identifier plusieurs éléments essentiels à l'obtention d'une forte interaction ligand-lectine. Basé sur ces études, le projet de recherche a consisté en la synthèse de différents analogues d'un disaccharide composé d'une unité fucose et glucosamine du type L-Fuc-a(1→4)-D-GIcNAcβ intimement impliqué dans le site de liaison de la protéine. Différents glycoclusters du disaccharide ont été synthétisés en utilisant la 'Click Chemistry'. De plus, quelques disaccharides modifiés en position C-2 et C-6 ont aussi été synthétisés. Les disaccharides ainsi que les glycoclusters ont été testés sur la PA-IlL en utilisant un test d'inhibition compétitive (ELLA). Les dérivés disaccharidiques ont montrés une constante de dissociation (Kd = 310 nM) dans le même ordre de grandeur que celle du meilleur ligand naturel Lewis a (Kd = 210 nM) connu jusqu'à maintenant pour la PA-IlL. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Pseudomonas aeruginosa, Fibrose kystique, Lectine PA-IlL, Lewis a, Glycosylation, «click chemistry», Glycoclusters.

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Celle-ci présente un défaut sur le canal à ions chlorures affectant ainsi entre autres la viscosité des muqueuses au niveau du système respiratoire. Cet environnement est alors propice aux colonisations bactériennes opportunistes sous la forme de biofilm. Burkholderia cepacia, bacille Gram-négatif mobile, multi-résistant aux antibiotiques et hautement transmissible, s'avère d'une extrême virulence pour les patients atteints de FK. Cette bactérie pathogène désigne en fait un ensemble de neuf souches rassemblées sous le nom de « complexe B. cepacia » (CBC). Au moins huit de ces neuf souches produisent un exopolysaccharide nommé Cepacian. Celui-ci est constitué d'un motif de répétition heptasaccharidique composé notamment de l'enchaînement α-D-Rhap-( 1→4 )-α-D-GlcpA. Le D-rhamnose (ou 6-deoxy-D-mannose) est un composant de glycoconjugués des parois de bactéries pathogènes mais ce sucre rare est absent chez l'homme. Ce dernier présente donc un fort potentiel antigénique dans le cadre de la préparation d'un vaccin entièrement synthétique et spécifique contre B. cepacia. L'élaboration de celui-ci consiste en un activateur universel immunogénique peptidique (Tc-épitope), PADRE ou P2TT préalablement synthétisés, fonctionnalisé par une unité antigénique spécifique. Dans ce but, deux tri-O·saccharides constituants du LPS de B. cepacia et composés majoritairement de D-rhamnose, ainsi que des fragments du motif de répétition de l'exopolysaccharide (EPS) du CBC ont été synthétisés. Des méthodes de synthèses orthogonales ont été optimisées avec de très hauts rendements sur les cinq différents sucres constituant l'EPS ou les LPS du CBC, et plus spécifiquement sur le D-rhamnose. Une série de glycosylation suivie d'une conjugaison finale via une addition radicalaire ou une métathèse croisée a conduit à deux méthodes de conjugaison pour la synthèse de vaccins potentiels, ceci constituant le but final du projet. La synthèse linéaire en 21 étapes a conduit au trisaccharide, α-D-Rhap-(1→3)-α-D-Rhap-(1→2)-α-D-Rhap, avec 36% de rendement global (ou 19% en 18 étapes optimisables). Un rendement de 28% a été obtenu pour une synthèse séquentielle en 17 étapes pour le trisaccharide majeur du LPS, α-D-Rhap-(1→3)-α-D-Rhap-(1→4)-α-D-Galp. La conjugaison de ce dernier sur T-cell épitope constituera l'ultime étape afin d'obtenir un vaccin potentiel entièrement synthétique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Vaccin synthétique, T-cell épitope, Burkholderia cepacia, Fibrose kystique, Oligosaccharide, D-rhamnose, Complexe B. cepacia.

La fibrose kystique est une maladie génétique et transmissible qui affecte particulièrement les fonctions respiratoires des patients atteints. Ce déclin du système respiratoire est entre autres le résultat de la présence de différents pathogènes causant des infections. Staphylococcus aureus est l'un des pathogènes les plus fréquemment retrouvés dans cet environnement. Ce pathogène pouvant être associé à différents types d'infections chez l'être humain, utilise différentes stratégies qui lui permettre [i.e. permettent] de tirer avantage des multiples environnements où il peut se retrouver. L'une de ces stratégies est d'adopter un phénotype particulier nommé : small-colony variant (SCV). Le profil transcriptionnel particulier des SCVs tend à les associer aux infections de type chronique. De plus, la résistance accrue aux aminoglycosides aussi bien qu'aux inhibiteurs de la voie des folates font des SCVs des pathogènes plus difficiles à éliminer par les traitements conventionnels. Malgré le fait que nos connaissances sur les SCVs ne cessent d'augmenter, les facteurs sous-jacents à leur présence dans certaines pathologies comme celle retrouvée chez les patients fibro-kystiques sont encore mal définis. Il est connu que certains facteurs tels que des antibiotiques et des exoproduits bactériens favorisent leur présence in vitro. Cependant, l'impact in vivo de ces facteurs ainsi que le rôle que jouent les infections à S. aureus chez ces patients ne sont toujours pas bien compris. Les projets présentés dans ce travail ont pour but de mieux caractériser les infections à S. aureus et plus particulièrement celles produites par les SCVs chez les patients atteints de cette maladie. Le premier volet est une étude clinique qui a permis de faire le constat de l'importante proportion d'isolats de S. aureus portant des résistances à différents antibiotiques cliniquement utilisés. Bien qu'aucun facteur environnemental n'ait pu être mis en cause pour la présence de SCVs, leur capacité à produire plus de biofilm ainsi que leur sensibilité réduite aux aminoglycosides a été mise en évidence. Malgré ces caractéristiques inquiétantes, les résultats de cette étude pilote semblent montrer que la présence de S. aureus et des SCVs à [i.e. a] peu d'impact sur les fonctions respiratoires des patients comparativement à P. aeruginosa. Cependant, il n'est pas exclu que la présence de S. aureus et des SCVs ait un effet important sur l'incidence de P. aeruginosa et les interactions bactériennes pouvant modulées [i.e. moduler] la santé des patients. Dans cette optique, le deuxième projet à [i.e. a] permis de mieux comprendre les mécanismes qu'utilisaient S. aureus lui permettant, face à la présence de P. aeruginosa, de passer au phénotype SCV. Ce projet connexe a démontré l'importance du facteur alternatif sigB dans le mécanisme d'acquisition du phénotype SCV en réponse au HQNO, un exoproduit de P. aeruginosa. Il a également permis de mieux comprendre les effets transcriptionnels de cette molécule sur S. aureus ainsi que son impact global sur la production de biofilm. Ces travaux ont contribué à mieux comprendre les infections bactériennes, en grande partie responsables de la diminution des fonctions respiratoires chez les patients atteints de la fibrose kystique. Éventuellement, ces travaux pourront permettre de mieux gérer ces infections et d'améliorer ainsi la qualité de vie des personnes aux prises avec cette pathologie, encore incurable.

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique autosomale récessive conduisant à une défaillance pulmonaire mortelle. Celle-ci est causée par l’expression dysfonctionnelle de l’allèle CFTR codant pour une protéine transmembranaire impliquée dans le transport Cl- des cellules de l’épithélium pulmonaire vers la lumière des voies respiratoires. Cette mutation induit la production d’un mucus visqueux qui entrave les voies respiratoires et favorise l’accumulation de bactéries pathogènes. L’éradication de cette présence bactérienne est maintenant l’enjeu primordial chez les patients FK afin de procurer un bien-être et de prolonger l’espérance de vie de ceux-ci. Le cheval de bataille de cette lutte au mieux-être du patient FK s’appuie en partie sur l’efficacité des antibiotiques. Cependant, nous nous heurtons à la capacité d’adaptation des bactéries face à l’antibiothérapie, ce qui nous conduit à développer sans cesse de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, l’essence de ce projet de recherche a été de caractériser l’efficacité de la tomatidine (TO); l’aglycone de la tomatine (un glycoalcaloïde), produit par les plants de tomate et de son analogue : la molécule FC04-100. Par le passé, notre laboratoire a établi que la TO possède une action antibactérienne contre Staphylococcus aureus prototype via l’inhibition de l’expression des facteurs de virulences associés au système de régulation ARG ainsi qu’en agissant comme potentialisateur d’action des aminoglycosides (AMI). De plus, la TO est également un inhibiteur de la réplication intracellulaire de S. aureus small-colony variant (SCV) infectant des cellules épithéliales pulmonaires différenciées (Calu-3). Le premier volet de mon projet a été consacré à l’évaluation du potentiel d’action de la TO contre S. aureus et Pseudomonas aeruginosa; deux bactéries fréquemment co-isolées des poumons des patients. Ainsi, lors de cette étude, j’ai démontré pour la première fois que la TO peut être employée seule contre S. aureus en tant qu’agent bactéricide lorsque celle-ci est utilisée en présence de P. aeruginosa. Ce phénomène dépend de la production par P. aeruginosa, du 2-heptyl-4-quinolone-N-oxide (HQNO) de l’endopeptidase LasA. De plus, j’ai évalué la possibilité d’utiliser un AMI et TO lorsque S. aureus et P. aeruginosa sont en co-culture afin de réduire la population bactérienne de ces deux pathogènes. Les résultats obtenus ont permis de démontrer qu’une combinaison, de tobramycine (TOB) et TO, permet d’inhiber significativement la croissance bactérienne d’un S. aureus résistant à la méthiciline (MRSA) résistant à la TOB et P. aeruginosa, co-cultivés en condition planctonique. Le deuxième volet de ma maîtrise visait à mesurer l’efficacité antibactérienne de FC04-100 en collaboration avec ma collègue Isabelle Guay. Pour ce projet, j’ai démontré l’efficacité de la combinaison FC04-100 et la gentamicine (GEN) contre un biofilm de S. aureus. Pour ce faire, j’ai utilisé une méthode de culture en microplaque 96 puits, permettant ainsi de former plusieurs bioflims et de tester plusieurs concentrations d’antibiotiques. Les résultats suite à l’exposition des biofilms à la combinaison TO-GEN ont démontré qu’il était possible de réduire significativement la viabilité bactérienne de S. aureus en biofilm. De plus, j’ai comparé l’efficacité de FC04-100 à TO dans un essai d’infection de cellules Calu-3 différenciées et infectées par une souche clinique de S. aureus SCV. Les résultats révèlent que ces deux composés diminuent significativement la viabilité bactérienne, et ce, en proportion similaire par rapport aux cellules infectées non traitées. L’ensemble des résultats obtenus dans ces deux projets a permis de démontrer clairement le potentiel antimicrobien de la TO et de son analogue FC04-100. Cette découverte apporte donc un nouveau squelette de molécule qui pourrait s’avérer utilisable comme antibiotique.

Bien que la fibrose kystique soit fondamentalement causée par une défectuosité génétique, les infections microbiennes sont la plus grande cause de mortalité des gens qui en sont atteints. La bactérie Staphylococcus aureus est un des pathogènes les plus communs associés à cette maladie et est la cause d'infections persistantes et difficiles à traiter. Des souches variantes de S. aureus formant de petites colonies (les s[barbelow]mall-c[barbelow]olony v[barbelow]ariants ou SCVs) sont fréquemment isolées des voies respiratoires des patients atteints de fibrose kystique lors d'infections bactériennes chroniques. Mon projet de doctorat a consisté à déterminer les bases moléculaires de la persistance des infections pulmonaires à S. aureus chez les patients atteints de fibrose kystique et, plus particulièrement, le rôle des SCVs dans l'établissement d'infections chroniques. Mes principaux efforts de recherche ont été dirigés vers la compréhension du rôle de gènes et de phénotypes influencés par le facteur de transcription sigma alternatif sigma B dont l'activité est accrue chez les SCVs. Les mécanismes moléculaires par lesquels ce facteur de transcription influence la formation de biofilm, la persistance à l'intérieur des cellules de l'hôte et l'infection proprement dite ont été étudiés. Je me suis aussi intéressé à la compréhension des différents facteurs environnementaux et mécanismes moléculaires favorisant la présence et la persistance de S. aureus dans les poumons des patients fibrokystiques. Mes efforts de recherche ont également été dirigés vers l'élaboration d'antibiothérapies alternatives permettant de combattre les infections chroniques à S. aureus

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par la mutation du gène codant pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Celle-ci présente un défaut sur le canal à ions chlorure affectant ainsi entre autres la viscosité des muqueuses au niveau du système respiratoire. Cet environnement est alors propice aux colonisations bactériennes opportunistes sous la forme de biofilm. Burkholderia cepacia, bacille Gram-négatif mobile, multi-résistant aux antibiotiques et hautement transmissible, s'avère d'une extrême virulence pour les patients atteints de FK. Cette bactérie pathogène désigne en fait un ensemble de neuf souches rassemblées sous le nom de « complexe B. cepacia » (CBC). Au moins huit de ces neuf souches produisent un exopolysaccharide nommé Cepacian. Ceci est constitué d'un motif de répétition heptasaccharidique composé notamment de l'enchaînement α-D-Rhap-(1→4)-α-D-GlcpA. Le D-rhamnose (ou 6-deoxy-D-mannose) est un sucre rare et un composant de glycoconjugués des parois de bactéries pathogènes mais est absent chez l'homme. Ce dernier est donc un excellent candidat antigénique dans le cadre de la préparation d'un vaccin entièrement synthétique et spécifique. L'élaboration de celui-ci consiste en un activateur universel immunogénique peptidique (Tc-épitope) et/ou protéique (semi-synthétique) fonctionnalisé par une unité antigénique spécifique. Dans ce but, un tri-O-saccharide de constituant de LPS de B. cepacia et composé majoritairement de D-rhamnose, ainsi que des fragments du motif répétition de l'exopolysaccharide du CBC ont été synthétisés. Des méthodes de synthèses orthogonales ont été optimisées avec de hauts rendements sur les cinq types de sucres du CBC, spécifiquement le D-rhamnose, et l'acide glucuronique ainsi qu'une série de glycosylations. La synthèse linéaire en 18 étapes conduit à l'α-D-Rhap-(1→4 )-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Rhap avec 11.3% de rendement global. La dernière étape sera la conjugaison de Tc-épitope par ce dernier afin d'obtenir un vaccin entièrement synthétique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Vaccin synthétique, T-cell épitope, Burkholderia cepacia, Fibrose kystique, Oligosaccharide, D-rhamnose, Complexe B. cepacia.

Les composés glycosidiques sont une classe de molécules organiques sous-estimée en chimie médicinale. En effet, la variété de protéines se liant à ce type de molécules est très grande et plusieurs de ces récepteurs sont impliqués dans des processus physiologiques importants tels que l'adhésion cellulaire, la régulation de la croissance, l'apoptose cellulaire et la xénotransplantation. Plusieurs maladies comme le cancer, la fibrose kystique, les infections virales et bactériennes utilisent les interactions glycoside-protéine dans le but d'envahir notre organisme. Le développement de molécules actives basé sur des glycomimétiques aurait l'avantage d'offrir une sélectivité accrue pour un récepteur en particulier selon la nature du glycoside greffé sur l'élément actif. La synthèse de ce type de molécules utilise des réactions de chimie organique moderne telles que des réactions catalysées par transfert de phase, des couplages au palladium (0) de type Sonogashira et Heck ainsi que des réactions spécifiques à la chimie des sucres comme la réaction de propargylation régiosélective impliquant un acétal d'étain. Deux classes d'inhibiteurs ont été synthétisées soient des S-galactosides et lactosides ainsi que des 2-désoxy-C-galactosides. De plus, le développement d'une méthodologie de synthèse de trisaccharides basée sur une réaction d'allylation stéréosélective impliquant un complexe titane-binol a été étudié. Les diverses études réalisées démontrent bien l'efficacité des molécules synthétisées face à divers récepteurs biologiques dont les galectines et la lectine PA-IL de Pseudomonas aeruginosa. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lectines, fibrose kystique, glycosides, glycomimétigues.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les déficiences en vitamines liposolubles sont fréquentes chez les patients atteints de la fibrose kystique (FK), mais la fréquence et les implications cliniques d’un déficit en vitamine K sont peu documentées. L’objectif de cette étude était d’évaluer les déficiences en vitamines liposolubles des patients adultes atteints de la FK et d’examiner les associations entre la concentration sérique de la vitamine K1 et le statut nutritionnel, la fonction pulmonaire et la tolérance au glucose. Nous avons effectué une étude transversale chez des patients adultes (≥ 18 ans, n =168) atteints de la FK. Les concentrations sériques de vitamine K1 ont été mesurées par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sur les prélèvements à jeun, obtenus lors du test d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HPGO) visant à dépister le diabète associé à la FK. Les patients ont été classés selon leur taux de vitamine K1 (sous-optimal défini comme < 0,30 nmol/L). Des taux sanguins sous-optimaux de vitamine K1 ont été observés chez 66 % des patients atteints de la FK. Les patients ayant un statut sous-optimal en vitamine K1 ont un risque plus élevé de colonisation par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, un indice de masse corporelle (IMC) plus bas et sont plus susceptibles d'avoir une insuffisance pancréatique exocrine. Une régression multivariée n'a pas réussi à démontrer des relations significatives entre les variables cliniques et les niveaux de vitamine K1 transformés en log. En utilisant un seuil pour la vitamine K1, nous avons montré des mesures réduites de la sécrétion d'insuline chez les patients ayant un statut en vitamine K1 inférieur à 0,30 nmol/L. Une association claire entre un statut sous-optimal en vitamine K1 et les mesures de la dysglycémie et de la sécrétion d'insuline n’a pas pu être démontrée. Nous soulignons les associations potentielles d'une carence légère en vitamine K avec une colonisation par la bactérie Pseudomonas et un IMC plus bas, bien que celles-ci doivent être validées dans des études prospectives. Ce mémoire contribue à l’amélioration des connaissances sur le statut en vitamine K chez les adultes atteints de la FK. / Patients with Cystic Fibrosis (CF) are at high risk of fat-soluble vitamin deficiencies, even with supplementation. The contribution of fat-soluble deficiencies to respiratory and endocrine pathophysiology in CF has been inadequately characterized. The aim of this observational study was to assess vitamin deficiencies in adult patients with CF, in the Montreal Cystic Fibrosis Cohort (MCFC). In particular, given the lack of evidence around the impact of vitamin K in CF, the purpose was to look at how vitamin K1 related to CF-related diabetes (CFRD) and whether there was a negative association between a suboptimal vitamin K1 status and measures of dysglycemia. We performed a cross-sectional study with baseline data from adult patients with CF (≥ 18 years old, n = 168). Serum vitamin K1 was measured with high performance liquid chromatography (HPLC) on fasting samples from an oral glucose tolerance test (OGTT) used for CFRD screening. Patients were categorized according to vitamin K levels (suboptimal defined as <0.30 nmol/L). Suboptimal vitamin K1 levels were observed in 66 % of patients. Patients with a suboptimal vitamin K1 status have a higher risk of colonization with Pseudomonas aeruginosa, lower BMI and were more likely to have exocrine pancreatic insufficiency. Multivariate regression failed to demonstrate significant relationships between clinical variables and log-transformed vitamin K1 levels. Using an established threshold for vitamin K1, we did show reduced OGTT-derived measures of insulin secretion in patients with a vitamin K1 status below 0.30 nmol/L. We failed to demonstrate a clear association between a suboptimal vitamin K status and measures of dysglycemia and insulin secretion. We highlight the potential associations of mild vitamin K deficiency with pseudomonal colonization and lower BMI, although these need to be validated in prospective studies. This study contributes to improving knowledge on vitamin K status in patients with CF.