La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique autosomale récessive conduisant à une défaillance pulmonaire mortelle. Celle-ci est causée par l’expression dysfonctionnelle de l’allèle CFTR codant pour une protéine transmembranaire impliquée dans le transport Cl- des cellules de l’épithélium pulmonaire vers la lumière des voies respiratoires. Cette mutation induit la production d’un mucus visqueux qui entrave les voies respiratoires et favorise l’accumulation de bactéries pathogènes. L’éradication de cette présence bactérienne est maintenant l’enjeu primordial chez les patients FK afin de procurer un bien-être et de prolonger l’espérance de vie de ceux-ci. Le cheval de bataille de cette lutte au mieux-être du patient FK s’appuie en partie sur l’efficacité des antibiotiques. Cependant, nous nous heurtons à la capacité d’adaptation des bactéries face à l’antibiothérapie, ce qui nous conduit à développer sans cesse de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, l’essence de ce projet de recherche a été de caractériser l’efficacité de la tomatidine (TO); l’aglycone de la tomatine (un glycoalcaloïde), produit par les plants de tomate et de son analogue : la molécule FC04-100. Par le passé, notre laboratoire a établi que la TO possède une action antibactérienne contre Staphylococcus aureus prototype via l’inhibition de l’expression des facteurs de virulences associés au système de régulation ARG ainsi qu’en agissant comme potentialisateur d’action des aminoglycosides (AMI). De plus, la TO est également un inhibiteur de la réplication intracellulaire de S. aureus small-colony variant (SCV) infectant des cellules épithéliales pulmonaires différenciées (Calu-3). Le premier volet de mon projet a été consacré à l’évaluation du potentiel d’action de la TO contre S. aureus et Pseudomonas aeruginosa; deux bactéries fréquemment co-isolées des poumons des patients. Ainsi, lors de cette étude, j’ai démontré pour la première fois que la TO peut être employée seule contre S. aureus en tant qu’agent bactéricide lorsque celle-ci est utilisée en présence de P. aeruginosa. Ce phénomène dépend de la production par P. aeruginosa, du 2-heptyl-4-quinolone-N-oxide (HQNO) de l’endopeptidase LasA. De plus, j’ai évalué la possibilité d’utiliser un AMI et TO lorsque S. aureus et P. aeruginosa sont en co-culture afin de réduire la population bactérienne de ces deux pathogènes. Les résultats obtenus ont permis de démontrer qu’une combinaison, de tobramycine (TOB) et TO, permet d’inhiber significativement la croissance bactérienne d’un S. aureus résistant à la méthiciline (MRSA) résistant à la TOB et P. aeruginosa, co-cultivés en condition planctonique. Le deuxième volet de ma maîtrise visait à mesurer l’efficacité antibactérienne de FC04-100 en collaboration avec ma collègue Isabelle Guay. Pour ce projet, j’ai démontré l’efficacité de la combinaison FC04-100 et la gentamicine (GEN) contre un biofilm de S. aureus. Pour ce faire, j’ai utilisé une méthode de culture en microplaque 96 puits, permettant ainsi de former plusieurs bioflims et de tester plusieurs concentrations d’antibiotiques. Les résultats suite à l’exposition des biofilms à la combinaison TO-GEN ont démontré qu’il était possible de réduire significativement la viabilité bactérienne de S. aureus en biofilm. De plus, j’ai comparé l’efficacité de FC04-100 à TO dans un essai d’infection de cellules Calu-3 différenciées et infectées par une souche clinique de S. aureus SCV. Les résultats révèlent que ces deux composés diminuent significativement la viabilité bactérienne, et ce, en proportion similaire par rapport aux cellules infectées non traitées. L’ensemble des résultats obtenus dans ces deux projets a permis de démontrer clairement le potentiel antimicrobien de la TO et de son analogue FC04-100. Cette découverte apporte donc un nouveau squelette de molécule qui pourrait s’avérer utilisable comme antibiotique.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第24910号 / 農博第2573号 / 新制||農||1102(附属図書館) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 小川 順, 教授 栗原 達夫, 教授 森 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Dans le but de mieux comprendre le mode d’action et de nous permettre de déterminer la cible de la tomatidine, nous avons dans un premier temps tenté de mieux circonscrire le spectre d’activité de la tomatidine. Grâce à ces travaux, nous sommes, en effet, maintenant en mesure de dire que la tomatidine possède une activité antibactérienne contre les espèces de la division des Firmicutes et plus précisément contre les bactéries de l’ordre des Bacillales dont font partie les genres Bacillus, Staphylococcus et Listeria. Nous avons également découvert, grâce à des expériences en collaboration avec le laboratoire d’Éric Marsault, qu’un analogue de la tomatidine (FC04-100) avait non seulement des propriétés similaires à la molécule naturelle, mais démontrait une activité par lui-même contre S. aureus à phénotype normal alors que la tomatidine possède uniquement une activité contre les « small colony variants ». De plus, alors que la tomatidine possède plutôt une activité bactériostatique contre la forme SCV de L. monocytogenes, le nouveau composé (FC04-100) démontre quant à lui, une forte activité bactéricide contre cette souche, tout comme contre la forme SCV des autres Bacillales. Parallèlement, et toujours dans le but de rechercher le mode d’action et la cible de la tomatidine, nous avons obtenu, par passages successifs dans un milieu avec antibiotiques, des mutants de S. aureus à phénotype normal et des SCV résistants à la tomatidine ou à la combinaison tomatidine et gentamicine. Après le séquençage de ces mutants, l’étude de la position de ces mutations, à l’aide de différents logiciels de bio-informatique, nous a permis d’émettre un modèle-hypothèse quant au mode d’action et à la cible de la tomatidine. Selon les résultats que nous avons à ce stade-ci, la cible de la tomatidine chez S. aureus serait la sous-unité c de l’ATP synthase. Cependant, son mode d’action serait également dépendant de la fonctionnalité de la chaine de transport des électrons et donc de la polarisation membranaire et de la production de ROS intracellulaire, ce qui expliquerait la différence d’activité entre les souches à phénotype normal et les SCV.

L’acquisition rapide de résistance aux antibiotiques par Staphylococcus aureus force le milieu hospitalier dans ses derniers retranchements au niveau des traitements antibactériens. Afin de pallier à ce problème, il est important de continuer à innover dans le développement de composés antibiotiques possédant des mécanismes d’action novateurs. Le groupe de François Malouin a récemment démontré que la tomatidine possède une activité antibactérienne et antivirulence contre différentes souches de Staphylococcus aureus, ainsi qu’un potentiel synergique avec les antibiotiques de la famille des aminoglycosides. La cible biologique et le mécanisme d’action de la tomatidine étant à ce jour inconnus, nous avons synthétisé une librairie de 34 analogues dans le but de comprendre la relation structure-activité de ce composé contre les souches persistantes de Staphylococcus aureus, ainsi que dans le but d’améliorer son activité biologique et mieux comprendre son mécanisme d’action. En nous basant sur l’hypothèse que le squelette stéroïdien standard servait principalement de support pour orienter les groupements pharmacophores, nous avons concentré les modifications chimiques sur les pharmacophores eux-mêmes, soit à la fonction hydroxyle en position 3 du cycle A, mais aussi à la fonction spiroaminocétale constituant les cycles E et F de la tomatidine. Les modifications de l’hydroxyle ont été effectuées à partir de la tomatidine elle-même. Nous avons testé l’effet de l’inversion de configuration, de l’allylation, de l’oxydation et de la substitution par différentes amines en cette position. Les modifications sur la fonction spiroaminocétale ont été synthétisées à partir de la tomatidine elle-même, mais également à partir de l’acétate de prégnénolone, un précurseur largement utilisé en chimie stéroïdienne. Dans le premier cas, les modifications ont consisté à synthétiser des analogues de la fonction spiroaminocétale bloquée en conformation fermée, ouverte ou partiellement ouverte. Dans le second cas, les modifications ont porté sur la synthèse d’analogue de la forme ouverte de la fonction spiroaminocétale. Tous les produits synthétisés ont été envoyés au laboratoire du Pr François Malouin afin d’être testés pour leur activité biologique. Les composés ont été testés afin de quantifier leur activité biologique contre S. aureus, seul ou en synergie avec la gentamicine, et également pour quantifier leur activité biologique contre les variantes de petite colonie de S. aureus, un phénotype bactérien souvent associé à des infections récurrentes et difficiles à traiter. Ces tests ont été effectués par Isabelle Guay, étudiante à la maîtrise en biologie à l’Université de Sherbrooke. Cette étude a mené à l’établissement des fondements de la relation structure-activité de la tomatidine envers S. aureus, ainsi qu’à la découverte de certains composés présentant une activité biologique améliorée. Ce travail a permis la rédaction d’un article scientifique intitulé « Unraveling the structure-activity relationship of tomatidine, a steroid alkaloid with unique antibiotic properties against persistent forms of Staphylococcus », soumis à European Journal of Medicinal Chemistry en juillet 2013, qui est présenté en ce mémoire.

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