Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur
des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande
grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le
mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend
difficile de lui trouver un substitut.
Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of
SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes
sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une
extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les
lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les
diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de
taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la
conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes
durant la conservation en séquestrant les protéines BSP.
Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction
entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en
trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les
protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont
une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une
affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction
entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1
bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5
× 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine.
L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum
principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces
résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les
protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les
protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons
démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées
dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du
lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait
être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre
BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur
de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences
entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf.
Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de
nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver
les spermatozoïdes des mammifères. / Skim milk is being used as a protective agent for mammalian semen conservation
over half a century. Recently, there has been increased interest in developing extenders
free of animal products. However, it is difficult to find suitable component in order to
replace milk as an extender, because the mechanisms by which milk protect sperm against
cooling and freezing damages during the storage is unknown.
The Binder of SPerm (BSP) proteins are the major proteins of bull seminal plasma
and they are harmful during sperm storage. In fact, sperm would be in contact with a large
quantity of BSP proteins that induce a continuous cholesterol and phospholipids efflux
from the sperm membrane during storage. When bull sperm is diluted with an extender
containing egg yolk, another compound frequently used in extender, the low-density
lipoproteins (LDL) present in the egg yolk prevent the binding of the BSP proteins to the
sperm membrane, thus, preventing the lipid efflux from the sperm membrane induced by
the BSP proteins. Our hypothesis was that milk proteins would protect sperm during
storage by binding BSP proteins.
First, we demonstrated by gel filtration that bovine BSP proteins could bind the
milk proteins. Skim milk was fractionated into three fractions: F1 (alpha-lactalbumin and beta-
lactoglobulin, the major whey proteins and kappa-casein), F2 (mainly caseins and all other
milk proteins in small amounts) and F3 (salts, sugars and small peptides). Bovine BSP1
and BSP5 have more affinity for F1 as compared to BSP3 and all the BSP proteins have
affinity for F2. We confirmed the interaction between bovine BSP proteins and milk
proteins by isothermal titration calorimetry. The binding of BSP1 to casein micelles is
characterized by an affinity constant (Ka) of 3.5 × 10^5 M-1 and of a stoichiometric
parameter for the association (n) of 4.5 BSP1 per casein. The association between BSP1
and alpha-lactalbumin (one of the major whey proteins) is characterized by a Ka of 2.4 × 10^5
M-1 and a “n” value of 0.8. These results support our contention that milk can protect
sperm by preventing the BSP proteins’ binding to the sperm membrane attributable to a
protein : protein interaction, while egg yolk sperm protection is attributable to a protein :
lipoprotein interaction. Second, our studies showed that the homologous BSP proteins
found in the boar, stallion and ram seminal plasma can bind the milk proteins. These
results indicate that the mechanism of sperm protection by milk in these species should be
similar to the one in bovine species. Third, we characterized the interaction between
bovine BSP1 protein and LDL from hen’s egg yolk. The binding was characterized by a
Ka of 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 and a « n » value of 104 BSP1 per LDL particle. Our results
indicated that there is difference between the mechanism of sperm protection by milk and
egg yolk.
We believe that the results presented in this thesis may help to create new
extenders free of animal product for mammal sperm preservation in liquid or frozen state.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/5265 |
| Date | 06 1900 |
| Creators | Lusignan, Marie-France |
| Contributors | Manjunath, Puttaswamy, Lafleur, Michel |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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