MicroRNAs are endogenous ≈22 nt long non coding RNA molecules that modulate gene expression
at the post transcriptional level by targeting mRNAs for cleavage or translational repression.
MicroRNA-mRNA interaction involves a contiguous and perfect pairing within complementary
sites usually in the 3’ UTR of the target mRNA. Heart failure is associated with myocyte
hypertrophy and death, due to compensatory pathological remodeling and minimal functional repair
along with microRNA deregulation.
In this study, we identified candidate microRNAs based on their expression strength in
cardiomyocytes and by their ability to regulate hypertrophy. Expression profiling from early and
late stages of heart failure showed several deregulated microRNAs. Of these microRNAs, miR-378
emerged as a potentially interesting microRNA that was highly expressed in the mouse heart and
downregulated in the failing heart. Antihypertrophic activity of miR-378 was first observed by
screening a synthetic miR library for morphologic effects on cardiomyocytes, and validated in vitro proving the tight control of hypertrophy by this miR. We combined bioinformatic target prediction analysis and microarray analysis to identify the targets of miR-378. These analyses suggested that factors of the MAP kinase pathway were enriched among miR-378 targets, namely MAPK1 itself (also termed ERK2), the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), growth factor receptor bound protein 2 (GRB2) and kinase suppressor of ras 1 (KSR1). Regulation of these targets by miR-378 was then confirmed by mRNA and protein expression analysis. The use of luciferase reporter constructs with natural or mutated miR-378 binding sites further validated these four proteins as direct targets of miR-378. RNA interference with MAPK1 and the other three targets prevented the prohypertrophic effect of antimiR-378, suggesting that they functionally relate to miR-378. In vivo restoration of disease induced loss of miR-378 in a pressure overload mouse model of hypertrophy using adeno associated virus resulted in partial attenuation cardiac hypertrophy and significant improvement in cardiac function along with reduced expression of the four targets in heart.
We conclude from these findings that miR-378 is an antihypertrophic microRNA in cardiomyocytes, and the main mechanism underlying this effect is the suppression of the MAP kinase-signaling pathway on four distinct levels. Restoration of disease-associated loss of miR-378 through cardiomyocyte-targeted AAV-miR-378 may prove as an effective therapeutic strategy in myocardial disease. / MicroRNAs sind ca. 22 Nukleotide lange endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die
Expression von Genen posttranskriptionell regulieren, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA
herbeiführen oder deren Translation hemmen. Die Interaktion von microRNA und mRNA erfolgt
durch perfekt komplementäre Bindung in der 3’-untranslatierten Region der Ziel-mRNA. Eine
Deregulation der Expression verschiedener microRNAs lässt sich bei Herzinsuffizienz beobachten.
Im insuffizienten Herzen laufen kompensatorische pathologische Remodellingprozesse ab und es
kommt unter anderem zu Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten.
Im Rahmen dieser Arbeit haben wir Kandidaten-microRNAs nach folgenden Kriterien identifiziert:
1) Expr e s s ions s t ä rke in Ka rdiomyozyt en, 2) Fähigke i t zur Regul a t ion von
Kardiomyozytenhypertrophie im Screening einer synthetischen microRNA-Bibliothek auf
Kardiomyozytengröße und 3) Regulation ihrer Expression in frühem und späten Stadium eines
murinen Herzinsuffizienzmodells. Aus den resultierenden Kandidaten-microRNAs wurde im
folgenden miR-378 näher untersucht. MiR-378 war im gesunden Mausherz stark exprimiert. Die
Expression nahm bei Herzinsuffizienz ab. Weiterhin hatte die Überexpression von miR-378 in
neonatalen Kardiomyozyten einen antihypertrophen Effekt. Im Gegenzug führte die Expression von
antimiR-378 zu einer verstärkten Hypertrophie. Zur Target-Suche wurden zum einen
bioinformatische Vorhersage-Datenbanken verwendet und zum anderen ein Microarray
durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine Anreicherung von Faktoren des MAP-Kinase-
Signalweges: Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1, auch als ERK2 bezeichnet), Insulinähnlicher
Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF1R), Wachstumsfaktorbindeprotein 2 (GRB2) und
Kinasesuppressor von Ras 1 (KSR1). Die Regulation dieser Targets durch miR-378 wurde durch
Bestimmung der mRNA- und Proteinexpression nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-378
bestätigt. Durch Luziferaseassays mit Reporterkonstrukten, die jeweils die exakten oder mutierte
Bindungsstellen der vier Targets enthielten, konnte gezeigt werden, dass die mRNAs der vier
Faktoren direkte Targets von miR-378 darstellen. Durch siRNA-mediierte Herabregulation der
Zielproteine konnte der prohypertrophe Effekt von antimiR-378 inhibiert werden. Daraus lässt sich
schließen, dass der Hypertrophie-Phänotyp direkt auf miR-378 zurückzuführen ist. Schließlich
wurde der Effekt von miR-378 im murinen Herzinsuffizienzmodell (Konstriktion der Aorta, TAC)
untersucht. TAC führte zu einer Abnahme der Expression von miR-378 im Herzen. Durch Adenoassoziierten
Virus (AAV) vermittelte exogene Expression von miR-378 wurde das Expressionslevel
des gesunden Herzens im TAC-Modell wiederhergestellt und die Expression der vier Targets
herabgesetzt. Dies resultierte in weniger ausgeprägten Kardiomyozytenhypertrophie sowie in einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion.
Aus diesen Daten schließen wir, dass miR-378 einen antihypertrophen Effekt auf Kardiomyozyten
hat, der wesentlich durch die Suppression des MAP-Kinase-Signalweges an vier Angriffspunkten
vermittelt wird. Die Wiederherstellung des “gesunden” Expressionsniveaus von miR-378 im
kranken Herzen durch Kardiomyozyten-spezifische Expression mit AAV-miR-378 könnte eine
Therapieoption bei Herzerkrankungen sein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:10091 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Ganesan, Jayavarshni |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/de/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0032 seconds