Spliceosomal U-rich small ribonucleoprotein particles (U snRNPs) are the major building
blocks of the nuclear pre-mRNA splicing machinery. The core composition of U snRNPs
includes the name giving U snRNA and a set of seven common (Sm) proteins termed Sm
B/B’, D1, D2, D3, E, F and G. These Sm proteins are arranged in the form of a toroidal ring on
the single stranded conserved sequence element in the snRNA to form the Sm core domain.
Even though U snRNPs assemble spontaneously in vitro, their assembly in vivo requires an
amazingly large number of trans-acting assembly factors united in the Protein Arginine
Methyltransferase 5 (PRMT5) and the Survival Motor Neuron (SMN) complexes. The
cytoplasmic assembly pathway of U snRNPs can be divided into the early and the late phase.
The early phase is dominated by the assembly chaperone, pICln, a subunit of the PRMT5
complex. This factor binds to Sm proteins and delivers them in a pICln-bound form to the
PRMT5 complex. The early assembly phase then segregates into two lines. In one assembly
line, a stable hexameric ring intermediate (6S complex) composed of pICln and the five Sm
proteins D1, D2, F, E and G, is formed. This intermediate forms at the PRMT5 complex but
dissociates from the latter upon completion of its assembly. Within the 6S complex, these Sm
proteins are pre-organized into respective spatial positions adopted in the assembled U
snRNP. The other assembly line forms a protein trimer composed of pICln, Sm B/B’ and D3,
which unlike the 6S complex is not released from the PRMT5 complex. As a consequence of
their association with pICln, Sm proteins are kinetically trapped and fail to proceed in the
assembly pathway. The late phase of the U snRNP formation is dominated by the SMN
complex, which resolves this kinetic trap by dissociating pICln from the pre-organized Sm
proteins and, subsequently catalyzes the loading of the Sm proteins on the U snRNA.
Even though basic principles of U snRNP assembly have been understood in some detail, the
question arises as to why cells employ sophisticated assembly machinery for the assembly
despite the reaction occurring spontaneously in vitro. A few studies have shown that the
system works towards rendering specificity to the assembly reaction. However, Sm proteins
in their free form expose hydrophobic surfaces to the cytosolic solvent. Hence, I reasoned that
the assembly machinery of snRNPs might also prevent Sm protein aggregation.
In this thesis, I describe the work that leads to the discovery of a multi-layered regulatory
network for Sm proteins involving post-transcriptional and post-translational surveillance
mechanisms. Here, I show that the reduced level of SMN (a key assembly factor of the late
phase) leads to the initial tailback of Sm proteins over pICln followed by the transcriptional
down regulation of Sm protein encoding mRNAs. In contrast, depletion of pICln, a key factor
of the early phase, results in the retention of Sm proteins on the ribosomes followed by their
degradation via autophagy. Furthermore, I show that exceeding levels of Sm proteins over
pICln caused by overexpression results in aggregation and mis-localization of Sm proteins.
Thus, my findings uncover a complex regulatory network that helps to maintain the cellular
U snRNP homeostasis by either preventing or clearing the unassembled Sm protein
aggregates when they are not faithfully incorporated into the U snRNPs. / Eukaryontische mRNA Moleküle werden häufig als Vorläufer (prä-mRNAs) hergestellt, und
durch diverse Prozessierungschritte zur reifen Form umgewandelt. Ein wichtiger Schritt ist
hierbei die Spleißreaktion, welche das Herausschneiden von Introns und die Ligation der
Exons zur reifen mRNA katalysiert. Dieser Prozess wird durch das sog. Spleißosom
ermöglicht, einer makromolekularen Maschinerie, deren wichtigste Bausteine Uridin-reiche
kleine Ribonukleoproteinpartikel (U snRNPs) sind.
Die spleißosomalen U snRNPs bestehen aus kleinen nicht-codierenden RNAs (U snRNA)
sowie spezifischen und allgemeinen Proteinen. Während die spezifischen Proteine definierte
Funktionen im Spleißprozess vermitteln, haben die allgemeinen Proteine, auch Sm Proteine
genannt, primär strukturelle Funktion und vermitteln wichtige Schritte der U snRNP
Biogenese. Jedes U snRNP Partikel enthält sieben Sm-Proteine (Sm B/B’, D1, D2, D3, E, F, G),
die sich ringförmig an einen einzelsträngigen Bereich der U snRNPs anlagern und so eine
toroidale Sm Corestruktur ausbilden. Obwohl die Zusammenlagerung dieses Sm Cores in
vitro spontan erfolgt, werden hierfür in vivo trans-agierende Assemblierungsfaktoren benötigt.
Diese agieren im Kontext zweier miteinander kooperierender Einheiten, die als PRMT5- und
SMN-Komplex bezeichnet werden. Die initiale Phase wird vom Assemblierungs-Chaperon
pICln dominiert, welches eine Untereinheit des PRMT5-Komplexes darstellt. Dieser Faktor
stabilisiert die Sm-Proteine in höhergeordneten oligomeren Einheiten, die als Bausteine für
die spätere Zusammenlagerungsreaktion dienen. pICln-assoziierte Sm-Proteine sind jedoch
kinetisch gefangen und können daher nicht spontan auf die snRNA geladen werden. Diese
Funktion übernimmt der SMN-Komplex, indem er die pICln-Sm Proteinkomplexe bindet und
gleichzeitig pICln dissoziiert. Der SMN-Komplex fügt dann im letzten Schritt die Sm Proteine
und die snRNA zum Sm Core zusammen.
Es stellte sich die prinzipielle Frage, weshalb Zellen für die U snRNP Biogenese eine
komplexe Maschinerie ermöglichen, wenn dieselbe Reaktion in vitro auch spontan erfolgen
kann. Eine Hypothese, die dieser Arbeit zu Grunde lag, war, dass das PRMT5/SMN System
in vivo notwendig ist, um die unspezifische Aggregation der hydrophoben Sm Proteine zu
vermeiden und deren spezifische Zusammenlagerung mit den snRNAs zu ermöglichen.
In der vorliegenden Arbeit werden Experimente geschildert, die diese Hypothese bestätigen
und ein vielschichtiges regulatorisches post-transkriptionelles und post-translationales
Netzwerk für die Sm-Proteine aufdeckten. Es wird gezeigt, dass eine verringerte Menge an
SMN, dem Schlüsselfaktor der späten Zusammenlagerungs-Phase, zu einem anfänglichen
Rückstau der Sm-Proteine an pICln zur Folge hat. Dieser Rückstau führt in einer späteren
Phase zur Herunterregulierung der mRNAs, die für die Sm-Proteine codieren. Im Gegensatz
dazu resultiert das Fehlen von pICln darin, dass die Sm-Proteine nicht in den
Zusammenlagerungsweg eintreten können und statt dessen durch Autophagie degradiert
werden. Wird die Degradation der Sm Proteine unterdrückt, komm es zu deren
Delokalisation in der Zelle und Aggregation in unphysiologischen Strukturen. Die Daten
offenbaren ein komplexes Regulationsnetzwerk, das die zelluläre U snRNP-Homöostase
aufrechterhält und Zellen vor potentiell toxischer Proteinaggregation bewahrt.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:14317 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Meduri, Rajyalakshmi |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/de/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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