Teniendo en cuenta el número de industrias alimentarias afectadas por el desarrollo de biofilms,
es imprescindible un análisis integral e interdisciplinario de los factores que intervienen en su
formación a fin desarrollar estrategias de remoción o prevención de estos. En esta tesis se
propuso como objetivo principal profundizar el conocimiento sobre la adhesión, formación y
producción de metabolitos en los biofilms formados por levaduras, principales deteriorantes de
la industria productora de jugos, en presencia de bacterias patógenas pertinentes a la seguridad
de los jugos de frutas, a fin de evaluar posibles estrategias de biocontrol.
En el Capítulo I, se analizaron los biofilms multiespecie formados por levaduras y su
asociación con bacterias patógenas, basándose en la hipótesis de que las levaduras presentes
en la microbiota residente de las superficies de los equipos de producción de jugos de frutas
pueden favorecer la persistencia de las bacterias a través de la formación de biofilms.
Inicialmente, se llevaron a cabo estudios de los parámetros relacionados con la formación de
biofilms de Listeria monocytogenes. Los resultados demostraron que Listeria exhibe un
carácter altamente hidrofóbico, es móvil, produce curli y celulosa, es viable en jugo de manzana
y se adhiere al acero inoxidable (AI) a 25 oC. Seguidamente, se describieron los biofilms
formados por Rhodotorula mucilaginosa, Candida tropicalis, Candida krusei y Candida kefyr,
en presencia de L. monocytogenes, Salmonella enterica o Escherichia coli O157:H7, sobre AI
y membranas de ultrafiltración (MUF), empleadas para la clarificación de los jugos. Los análisis
sobre los biofilms se realizaron empleando técnicas de recuento en placa, microscopía de
fluorescencia y microscopía electrónica de barrido. Los resultados revelaron que las estructuras
levaduriformes (pseudohifas, blastoporas) proporcionan un entorno propicio para el anclaje y
la adhesión de las bacterias patógenas, convirtiéndose así en un nicho elegible para su
permanencia en un ambiente que simula la producción de jugos de frutas.
En el Capítulo II, se exploró la actividad inhibitoria y antibiofilm de Lacticaseibacillus
rhamnosus GG ATCC 53103 (LGG) y Lactobacillus casei ATCC 393 frente a L.
monocytogenes, S. enterica y E. coli O157:H7. Se evaluaron dos estrategias de biocontrol:
competencia, en la cual tanto las células de Lactobacillus como las bacterias patógenas
colonizan simultáneamente la superficie de AI; y exclusión, donde se forma un biofilm
protector con células de Lactobacillus sobre la superficie de AI previo a la incorporación de
las bacterias patógenas. Ambas especies de Lactobacillus: presentaron alta capacidad adhesiva
sobre AI, sin alterar los parámetros fisicoquímicos del jugo de manzana. Además, estas cepas
mitigaron la proliferación y adhesión de las bacterias patógenas hasta niveles no detectables en
AI. Estos resultados sugieren que las cepas de Lactobacillus estudiadas podrían ser candidatas
prometedoras para la formación de biofilms protectores en entornos de producción de jugos,
ofreciendo una estrategia efectiva para controlar la adhesión microbiana en superficies
relacionadas con la industria alimentaria.
Con el objetivo de reducir o prevenir la colonización de las levaduras en las superficies y, de
este modo, evitar la adhesión de bacterias patógenas que puedan entrar al sistema de producción
de jugos de frutas, en el Capítulo III se evaluó la eficacia de moléculas quorum sensing (MQS)
producidas por levaduras y del agente antifúngico natamicina (NAT), que se utiliza
habitualmente en la industria alimentaria. En primer lugar, se identificaron compuestos
orgánicos volátiles (VOC) en biofilms de levaduras, y cuantificaron en presencia y ausencia de
bacterias patógenas afectaba su producción. La técnica de extracción con disolventes y la micro
extracción en fase sólida se emplearon para la extracción de COV, seguida de un análisis
mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas. Los resultados
demostraron que los biofilms de C. tropicalis producen farnesol (FAR), tirosol (TIR) y 2-
feniletanol (2-FE), tres compuestos reconocidos como MQS. Por otro lado, la presencia de las
bacterias patógenas no afectó significativamente (p>0,05) la producción de los COV liberados
por las levaduras. En segundo lugar, se analizó el efecto de farnesol 0,06 mM (FAR) en
combinación con natamicina 0,01 mM (NAT) sobre biofilms de levaduras y multiespecie
formados sobre AI y MUF. Los biofilms tratados con NAT+FAR mostraron inhibición de la
filamentación de las levaduras y una alteración significativa de la estructura tridimensional
tanto en AI como en MUF. Además, se observó una disminución en la adhesión de L.
monocytogenes, S. enterica y E. coli O157:H7 en los biofilms multiespecie. La combinación
NAT+FAR podría considerarse un agente de control prometedor para prevenir la formación de
biofilms en las líneas de procesamiento de jugo de manzana. / Considering the number of food industries affected by the development of biofilms, a
comprehensive and interdisciplinary analysis of the factors involved in their formation is
essential to develop strategies for their removal or prevention. The main objective of this thesis
was to deepen the knowledge of the adhesion, formation, and production of metabolites in
biofilms formed by yeasts, the main spoilage agents in the juice production industry, in the
presence of pathogenic bacteria relevant to the safety of fruit juices, to evaluate possible
biocontrol strategies.
Chapter I examined the association between yeasts and foodborne pathogens in biofilms
multispecies, based on the hypothesis that yeasts present in the resident microbiota on the
surfaces of fruit juice production equipment may favour the persistence of bacteria through the
formation of biofilms. Initially, studies were carried out on parameters related to biofilm
formation of Listeria monocytogenes. Results indicate that Listeria has a highly hydrophobic
character, is mobile, produces both curli and cellulose, is viable in apple juice, and adheres to
stainless steel (SS) at 25 °C. Biofilms formed by Rhodotorula mucilaginosa, Candida
tropicalis, Candida krusei, and Candida kefyr in the presence of L. monocytogenes, Salmonella
enterica or Escherichia coli O157:H7 on SS and ultrafiltration membranes (UFM), were
described. Biofilm analyses were performed using plate counting, fluorescence microscopy and
scanning electron microscopy techniques. The results revealed that yeast-like structures
(pseudohyphae, blastopores) supply a favourable environment for adhesion and adhesion of
pathogenic bacteria, thus becoming an eligible niche for their permanence in an environment
that simulates fruit juice production.
Chapter II aimed to investigate the inhibitory and antibiofilm efficacy of Lacticaseibacillus
rhamnosus GG ATCC 53103 (LGG) and Lactobacillus casei ATCC 393 against L.
monocytogenes, S. enterica and E. coli O157:H7. Two biocontrol strategies were evaluated:
competition, in which Lactobacillus cells and pathogenic bacteria colonise the SS surface at
the same time; exclusion, in which a protective biofilm with Lactobacillus cells is formed on
the SS surface and pathogenic bacteria are after incorporated. Both Lactobacillus species
adhered to AI, without altering the physicochemical parameters of the apple juice. Furthermore,
these strains mitigated the proliferation and adhesion of pathogenic bacteria to undetectable
levels on AI. These results suggest that the studied Lactobacillus strains could be promising
candidates for the formation of protective biofilms in juice production environments, offering
an effective strategy to control microbial adhesion on food industry-related surfaces.
To reduce or prevent yeast colonization on surfaces and thus avoid the adhesion of pathogenic
bacteria that may enter the fruit juice production system, the efficacy of quorum sensing
molecules (QSM) produced by yeasts and the antifungal agent natamycin (NAT), which is
commonly used in the food industry, was evaluated in Chapter III. First, it was identified and
quantified the volatiles organic compounds (VOC) released by the yeast biofilms, and then, it
was assessed whether the presence of pathogenic bacteria affected the production of these
metabolites. The solvent extraction technique and solid phase microextraction were used for
metabolite extraction, followed by analysis by gas chromatography coupled to mass
spectrometry. The results showed that C. tropicalis biofilms produce farnesol (FAR), tyrosol
(TIR) and 2-phenylethanol (2-FE), recognized as MQS. On the other hand, the presence of the
pathogenic bacteria did not significantly (p>0.05) alter the production of the VOC released by
the yeasts. Second, it was evaluated the effect of farnesol 0.06 mM with NAT 0.01 mM on
yeast and multispecies biofilms formed on SS and UFM. Biofilms treated with NAT+FAR
showed inhibition of yeast filamentation and a significant alteration of the three-dimensional
structure of both AI and MUF. In addition, decreased adhesion of L. monocytogenes, S. enterica
and E. coli O157:H7 was observed in the multispecies biofilms. The NAT+FAR combination
could be considered as a promising control agent to prevent biofilm formation in apple juice
processing lines.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/6482 |
| Date | 26 June 2023 |
| Creators | Agustín, María del Rosario |
| Contributors | Brugnoni, Lorena Inés, Vela Gurovic, María Soledad |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Format | application/pdf |
| Rights | 2 |
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