Η δοξορουβικίνη αποτελεί μια ευρέως χρησιμοποιούμενη αντικαρκινική ένωση σε διάφορους τύπους νεοπλασιών και ανήκει στην οικογένεια των ανθρακυκλινών. Για την κυτταροστατική της δράση έχουν προταθεί διάφοροι μηχανισμοί, μεταξύ των οποίων επαγωγή απόπτωσης και γενετικές αλλαγές. Η απόπτωση αποτελεί μια φυσιολογική διαδικασία, η οποία ελέγχει τον αριθμό των κυττάρων σ’ έναν οργανισμό. Λειτουργεί ως αμυντικός μηχανισμός σε περιπτώσεις κυττάρων που έχουν υποστεί βλάβη και παρεμποδίζει την εξάπλωση μεταλλάξεων συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που οδηγούν σε καρκινογένεση. Η απόπτωση μπορεί να ενεργοποιηθεί κυρίως μέσω της εξωγενούς και της ενδογενούς οδούς.
Στην παρούσα ερευνητική εργασία μελετήθηκε η σχέση επαγωγής απόπτωσης και γενετικών βλαβών που προκαλούνται από τη δοξορουβικίνη σε κυτταρική σειρά ποντικού C2C12. Για τη διερεύνηση των γενετικών βλαβών μελετήθηκε η συχνότητα των μικροπυρήνων (ΜΝ) με χρώση DAPI. H επαγωγή απόπτωσης εξετάστηκε με τη μέθοδο διπλής χρώσης αννεξίνη V/ιωδιούχο προπίδιο. Η μελέτη του μηχανισμού προέλευσης των μικροπυρήνων πραγματοποιήθηκε με σήμανση πρωτεϊνών του κινητοχώρου, την ανοσοχημική μέθοδο CREST σε συνδυασμό με ανοσοσήμανση της α-τουμπουλίνης για την εμφάνιση του κυτταροπλάσματος.
Παρατηρήθηκε ότι η δοξορουβικίνη στις μελετηθείσες συγκεντρώσεις (0.05 μg/ml, 0.10 μg/ml, 0.20 μg/ml, 1.00 μg/ml, 2.50 μg/ml και 5.00 μg/ml,) προκαλεί αυξημένες συχνότητες αποπτωτικών κυττάρων και κυττάρων που περιέχουν μικροπυρήνες. Διαπιστώθηκε ότι η αύξηση της απόπτωσης σχετίζεται με μείωση της συχνότητας των μικροπυρήνων, υποδεικνύοντας πιθανή συμμετοχή της απόπτωσης στον περιορισμό των κυττάρων που φέρουν γενετική βλάβη. Η μελέτη του μηχανισμού προέλευσης των μικροπυρήνων έδειξε ότι η δοξορουβικίνη επάγει τη χρωμοσωματική θραύση και σε μικρότερο βαθμό τη χρωμοσωματική καθυστέρηση. Η τελευταία παρατήρηση μας οδήγησε στη μελέτη της οργάνωσης της μιτωτικής συσκευής μετά την επίδραση με δοξορουβικίνη. Η μιτωτική συσκευή αποτελεί στόχο χημικών ενώσεων που επηρεάζουν το χρωμοσωματικό αποχωρισμό και η μελέτη της πραγματοποιήθηκε με διπλή ανοσοσήμανση για τους μικροσωληνίσκους (β-τουμπουλίνη) και το κεντρόσωμα (γ-τουμπουλίνη). Παρατηρήθηκαν επίσης, ανώμαλες μεταφάσεις και τροποποιημένος αριθμός κεντροσωμάτων, φαινόμενα που σχετίζονται με λανθασμένο χρωμοσωματικό αποχωρισμό. Τέλος σε προκαταρκτικά πειράματα κατά τα οποία πραγματοποιήθηκε αναστολή της απόπτωσης που προκαλείται από τη δοξορουβικίνη με το γενικό αναστολέα Z-VAD-fmk, παρατηρήθηκε αύξηση της συχνότητας των κυττάρων με μικροπυρήνες που προκαλούνται από την ίδια ένωση. Η παρατήρηση αυτή αποτελεί μια ακόμη ένδειξη για την πιθανή συμμετοχή της απόπτωσης στον περιορισμό των κυττάρων με γενετικές αλλαγές. Επίσης παρατηρήθηκε ότι η αναστολή της απόπτωσης τροποποιεί τη συχνότητα των κυττάρων με ανώμαλο αριθμό κεντροσωμάτων που επάγονται από τη δράση της δοξορουβικίνης, αυξάνοντας τα κύτταρα με ένα κεντρόσωμα και μειώνοντας τα κύτταρα με πολλαπλά κεντροσώματα, υποδεικνύοντας πιθανή εμπλοκή της απόπτωσης στο σχηματισμό ασύμμετρων κυτταρικών διαιρέσεων. Οι τελευταίες παρατηρήσεις χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση. / Doxorubicin is one of the most widely used anticancer drugs due to its broad spectrum of antitumor activity and belongs to the family of anthracyclines. Various mechanisms have been proposed for its cytostatic activity, including induction of apoptosis and genetic alterations. Apoptosis is a normal procedure which provides a cell control mechanism. It is a defense mechanism for the elimination of mutated cells including those that might cause carcinogenesis. Apoptosis is carried out by intrinsic as well as extrinsic pathways.
In the present thesis we investigated the relationship between apoptosis and genetic damage induced by doxorubicin in C2C12 mouse cell line. Genetic damage was evaluated by studying the micronucleus (MN) frequency by DAPI staining.The induction of apoptosis was examined by double fluorescence staining of ANNEXIN V/PI. The analysis of the mechanism by which the micronuclei are induced was further investigated by kinetochore labeling using the immunocytochemical method CREST with simultaneous labeling of α- tubulin, for the detection of cytoplasm.
It was observed that doxorubicin at the studied concentrations (0.05 μg/ml, 0.10 μg/ml, 0.20 μg/ml, 1.00 μg/ml, 2.50 μg/ml and 5.00 μg/ml) increased frequencies of apoptotic and micronucleated cells. It was shown that the induction of apoptosis was related with decreased micronucleus frequency, indicating a possible involvement of apoptosis in the elimination of the micronucleated cells. The analysis of the mechanism of micronucleus formation showed that doxorubicin induced chromosome breakage and in a lesser extent chromosome loss. The latter ability was further investigated by analyzing the integrity of mitotic apparatus after exposure to doxorubicin. The mitotic apparatus consists one of the main targets of chemical compounds which induce chromosome missegregation. The analysis was achieved by double immunofluorescence staining for microtubules (β-tubulin) and for centrosome (γ- tubulin). It was shown that doxorubicin provoked high abnormal metaphase figures and abnormal centrosome numbers, phenomena that are related with abnormal chromosome segregation. Finally, preliminary experiments, where doxorubicin-induced apoptosis was inhibited by the pancaspase inhibitor Z-VAD-fmk, resulted to an increase of the frequency of micronucleated cells generated by doxorubicin. This observation is an additional evidence for the involvement of apoptosis in the elimination of cells with genetic damage. Moreover, it was observed that inhibition of apoptosis altered the frequency of cells with abnormal centrosome number, which are formed after doxorubicin treatment, by increasing cells with only one centrosome and decreasing cells with multiple centrosomes, indicating a possible participation of apoptosis in the formation of asymmetric divisions. Further investigation is warranted to clarify the last observations.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1071 |
| Date | 11 November 2008 |
| Creators | Τροχούτσου, Αικατερίνη |
| Contributors | Στεφάνου, Γεωργία, Trochoutsou, Katerina, Γιαννόπουλος, Γεώργιος, Δημόπουλος, Νικόλαος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0033 seconds