Στα έντομα, η κυτταροφαγία, διεργασία ανάλογη με αυτή των θηλαστικών, είναι μια σημαντική ανοσολογική απόκριση στην εισβολή παθογόνων και ρυθμίζεται από μια σειρά σηματοδοτικών μορίων. Στη μύγα της Μεσογείου έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν οι κινάσες FAK, Src, MAPK και ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1. Στην εργασία αυτή, δείχτηκε με ανοσοκατακρήμνιση και συνεστιακή μικροσκοπία ότι η φωσφορυλιωμένη μορφή του Elk-1 συμπλοκοποιείται και συνεντοπίζεται μόνο με τη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK στη θέση Tyr925. Με ανάλογα πειράματα διαπιστώθηκε ότι οι κινάσες JNK και p38 συμπλοκοποιούνται και συγκατακρημνίζονται με την FAK, χωρίς όμως να συνεντοπίζονται. Με τον ίδιο τρόπο διαπιστώθηκε ότι η JNK και η p38 συμπλοκοποιούνται με την ERK1/2, χωρίς όμως να συνεντοπίζονται. Προφανώς τα μόρια αυτά δεν βρίσκονται σε άμεση επαφή μεταξύ τους και συμπλοκοποιούνται είτε μέσω της FAK, είτε μέσω τρίτων μορίων και όλα μαζί προσδένονται στην FAK.
Τα φαγοκύτταρα των θηλαστικών, μακροφάγα και ουδετερόφιλα, καθώς και τα αιμοκύτταρα των εντόμων, παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου κατά την κυτταροφαγία, οι οποίες δρουν ως δεύτερα μηνύματα. Με κυτταρομετρία ροής διαπιστώθηκε ότι η E. coli επάγει τη σύνθεση Η2Ο2 από τα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου. Ο ρυθμιστικός ρόλος του Η2Ο2 επιβεβαιώθηκε με τη χρήση αναστολέων των ενζύμων παραγωγής Ο2- και Η2Ο2, όπου παρατηρήθηκε αύξηση της κυτταροφαγίας. Με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης, ανοσοαποτύπωσης και ανοσοφθορισμού φάνηκε ότι το ένζυμο σύνθεσης του Η2Ο2, η δεσμουτάση του υπεροξεικού ανιόντος (SOD), υπάρχει στο κυτταρόπλασμα και στην πλασματική μεμβράνη. Η αποσιώπηση της SOD με siRNA, αύξησε την κυτταροφαγία. Με ανοσοαποτύπωση διαπιστώθηκε ότι η αναστολή της παραγωγής του Η2Ο2 αύξησε τη φωσφορυλίωση της ERK1/2. Τέλος, με συνεστιακή μικροσκοπία φάνηκε ότι η SOD δεν συνεντοπίζεται με τη β υπομονάδα των ιντεγκρινών. Φαίνεται λοιπόν το Η2Ο2 να εμποδίζει την κυτταροφαγία μέσω ελέγχου της φωσφορυλίωσης της ERK1/2. / Phagocytosis is an important innate immune response against pathogen, with similar mechanisms in insects and mammals and is regulated by many different signalling molecules. In medfly Ceratitis capitata, focal adhesion kinase (FAK), Src, MAP kinases and Elk-1 transcription factor regulate this process. Co-immunoprecipitation and confocal microscopy analysis showed that pTyr925FAK associates and co-localizes with pElk-1, during phagocytosis of E. coli and S. aureus, by medfly haemocytes. Moreover, the physical association between JNK and p38 MAP kinases with FAK, was confirmed by immunoprecipitation, but confocal analysis revealed no co-localisation. Similar experiments for JNK and p38 with ERK1/2, revealed an association between JNK, p38 and ERK1/2 and no co-localisation. Apparently, these molecules do not interact directly but they appear to associate with each other indirectly, via FAK molecule or a third molecule and thus all together associate with FAK.
Hydrogen peroxide (Η2Ο2) participates as a second messenger in cell signalling in either macrophages and polymorphonuclear cells or insect haemocytes. In this work, the role of Η2Ο2 was investigated, in E. coli phagocytosis by the medfly haemocytes. Block of H2O2 synthesis by specific enzymic inhibitors, namely N-ethylmaleimide (ΝΕΜ) for NADPH oxidase and diethyldithiocarbamate (DDC) for SOD, resulted in the increase of E. coli phagocytosis. Immunoblot analysis, flow cytometry and confocal microscopy, revealed the constitutive expression of SOD, in the medfly haemocytes. Phagocytosis increased by small interfering RNA (siRNA) for SOD, revealing the active involvement of SOD and Η2Ο2. Immunoblot analysis showed an increase of the ERK1/2 phosphorylation, in the presence of the above H2O2 synthesis enzymic inhibitors. In addition, confocal microscopy showed no co-localization of SOD with β integrin subunit. It appears that SOD participates in the regulation of bacterial phagocytosis, due to involvement of the produced Η2Ο2 in the differential phosphorylation of MAP kinases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/4487 |
| Date | 08 July 2011 |
| Creators | Αρμπή, Μαρίνα |
| Contributors | Κατσώρης, Παναγιώτης, Arbi, Marina, Μαρμάρας, Βασίλειος, Γεωργίου, Χρήστος, Κατσώρης, Παναγιώτης |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0025 seconds