Το υδρόθειο (H2S) είναι ένα άχρωμο, εύφλεκτο αέριο με τη χαρακτηριστική οσμή του κλούβιου αυγού. Τα τελευταία χρόνια έχει αναγνωριστεί ο ρόλος του ως ένα σηματοδοτικό μόριο για το καρδιαγγειακό και το νευρικό σύστημα και είναι το τρίτο μέλος της οικογένειας των αέριων διαβιβαστών. Παράγεται ενδογενώς μέσω του μεταβολισμού της L-κυστεΐνης από δυο ένζυμα: τη β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (CBS) και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE). Ένας τρίτος τρόπος σύνθεσης του H2S από L-κυστεΐνη που ανακαλύφθηκε πρόσφατα είναι μέσω της συνδυασμένης δράσης της σουλφοτρανσφεράσης του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού και της αμινοτρανσφεράσης της κυστεΐνης (3MST/CAT). Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την εκλεκτικότητα των διαθέσιμων φαρμακολογικών αναστολέων της σύνθεσης του H2S που επιδρούν στα ένζυμα παραγωγής του, CBS και CSE. Για την υλοποίηση της μελέτης έγινε η έκφραση των ενζύμων CSE και CBS ως χιμαιρικές πρωτεΐνες με GST σε βακτήρια E.coli και ακολούθησε η απομόνωση αυτών με χρωματογραφία συγγένειας με τη χρήση στηλών που έχουν ακινητοποιημένη σε σεφαρόζη τη γλουταθειόνη. Έπειτα ελέγχθηκε η δραστικότητα των ανασυνδυασμένων ενζύμων με την μέθοδο του μπλε του μεθυλενίου και στη συνέχεια εξετάσθηκαν οι αναστολείς έναντι και των δυο ενζύμων CSE και CBS. Τα αποτελέσματα μας επιβεβαιώνουν την εκλεκτικότητα της προπαργυλογλυκίνης (PAG) και της β-κυανοαλανίνης (BCA) για το CSE. Από τη μελέτη μας βρέθηκε ότι η β-κυανοαλανίνη (BCA) είναι ισχυρότερος αναστολέας του CSE από την προπαργυλογλυκίνη (PAG) με IC50 14μΜ και 750μΜ, αντίστοιχα. Το αμινο-οξικό οξύ (ΑΟΑΑ) βρέθηκε ότι είναι πιο ισχυρός αναστολέας για το CSE (IC50 1,1μΜ) παρά για το CBS (IC50 8,5μΜ), παρόλο που θεωρητικά είναι εκλεκτικός αναστολέας του CBS. Μάλιστα είναι ισχυρότερος των PAG και BCA, για το CSE. Η τριφθοροαλανίνη και η υδροξυλαμίνη ανέστειλαν και τα δυο ένζυμα, με την τριφθοροαλανίνη να είναι πιο ισχυρός αναστολέας του CBS, ενώ η υδροξυλαμίνη του CSE. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκαν επίσης κάποιες νέες ουσίες ως πιθανοί αναστολείς του CSE, οι οποίες δε φαίνεται να είχαν την ικανότητα να προκαλέσουν σημαντική αναστολή του ενζύμου αυτού. Συμπερασματικά, παρόλο που οι αναστολείς PAG και BCA εμφανίζουν εκλεκτικότητα ως προς το CSE έναντι του CBS, δεν υπάρχει, προς το παρόν, κανένας εκλεκτικός αναστολέας για το CBS. / Hydrogen sulphide (H2S) is a colorless, flammable gas with the characteristic smell of rotten eggs. H2S is now recognized as an important signalling molecule in the cardiovascular and nervous systems and is the third member of the gasotransmitter family. H2S is synthesized via two pyridoxal-5′-phosphate-dependent enzymes responsible for the metabolism of L-cysteine: cystathionine beta synthase (CBS) and cystathionine gamma lyase (CSE), as well as by a recently identified third pathway that catalyzes the production of H2S from L-cysteine via the combined action of 3-mercaptopyruvate sulphurtransferase and cysteine aminotransferase (3MST/CAT). In the present study we examined the selectivity of commonly used pharmacological inhibitors of H2S biosynthesis towards CSE and CBS. To address this question human CSE or CBS enzymes were expressed and purified from E. coli as fusion proteins with Glutathione-S-Transferase (GST). After purification the activity of the recombinant enzymes was tested using the methylene blue method. We found that β-cyanoalanine (BCA) was a more potent CSE inhibitor than propargylglycine (PAG) (IC50 14μΜ and 750μΜ, respectively), and that aminooxyacetic acid (AOAA) was even more potent than BCA and PAG towards CSE (IC50 1.1μΜ), although it is claimed to be a CBS-selective inhibitor; AOAA inhibited CBS with an IC50 8.5μΜ. Trifluoroalanine and hydroxylamine inhibited both enzymes with the former being a more potent inhibitor of CBS, while the later of CSE. We also examined some new synthesized substances as CSE inhibitors. In conclusion, although PAG and BCA exhibit selectivity in inhibiting CSE vs CBS, no selective CBS inhibitor is currently available.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5879 |
| Date | 28 February 2013 |
| Creators | Ασημακοπούλου, Αντωνία |
| Contributors | Παπαπετρόπουλος, Ανδρέας, Asimakopoulou, Antonia, Σπυρούλιας, Γεώργιος, Τοπούζης, Σταύρος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0082 seconds