Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι ομο- ή ετεροπενταμερείς διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες, σχηματίζοντας ιοντικά κανάλια, συμβάλλουν στην λειτουργία του μυικού και νευρικού συστήματος. Η επικείμενη εμπλοκή των υποδοχέων αυτών σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του οργανισμού, επιβάλλει τη γνώση της δομής τους, απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη εξειδικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων.
Μέχρι τώρα, δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του μορίου του ανθρώπινου υποδοχέα μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ή μέσω πειραμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η απουσία των συγκεκριμένων πληροφοριών, οφείλεται στη φύση του μορίου του υποδοχέα όπως η ύπαρξη των υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών, το μέγεθος του μορίου καθώς και η αδυναμία απομόνωσης σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές.
Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια υδατοδιαλυτά, λειτουργικά, με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωσή τους και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Τα τμήματα του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία συγκεντρώνουν τις παραπάνω προϋποθέσεις, είναι τα εξωκυτταρικά αμινοτελικά πολυπεπτίδια των διαφόρων υπομονάδων που τον αποτελούν. Από την άλλη πλευρά, ο οργανισμός που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως σύστημα ετερόλογης έκφρασης, πρέπει να είναι εύκολος στους χειρισμούς του, γρήγορος, οικονομικός, με μεγάλο επίπεδο έκφρασης (όπως τα βακτήρια π.χ. E.coli) αλλά ταυτόχρονα να έχει την ικανότητα να πραγματοποιεί μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες που εκφράζει ώστε τα παραγόμενα μόρια να μπορούν να αναδιπλωθούν (όπως τα ευκαρυωτικά κύτταρα). Άρα, για να προκύψουν τα επιθυμητά μόρια, σύμφωνα με τις παραπάνω προϋποθέσεις, εκφράστηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα (ECDs) των ανθρώπινων υπομονάδων α1, α4 και β2 στο υπερκείμενο καλλιέργειας του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα P. pastoris.
Αρχικά, μελετήθηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα των α4 και β2 υπομονάδων με διαφορετικούς επιτόπους ώστε να γίνει η επιλογή του καλύτερου συνδιασμού που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για έκφραση των δύο υπομονάδων στο ίδιο σύστημα. Η έκφραση των α4 και β2 ECDs με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό τους άκρο (α4-ECD-6xHis και β2-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση μικρών ποσοτήτων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων τα οποία κρίνονται ακατάλληλα για δομικές μελέτες εξαιτίας της υδροφοβικότητας και κατά συνέπεια του μεγέθους τους. Όταν πραγματοποιήθηκε αλλαγή της υδρόφοβης περιοχής μεταξύ των κυστεινών 128 και 142 με την αντίστοιχη υδρόφιλη ολιγοπεπτιδική αλληλουχία της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη (AChBP) στις ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες, παρατηρήθηκε αισθητή βελτίωση για την β2-ECD υπομονάδα (β2-cysloop-ECD-6xHis) τόσο σε επίπεδο έκφρασης όσο και στο μέγεθος το οποίο σχηματίζει. Ωστόσο, παρόμοια βελτίωση για την α4-cysloop-ECD-6xHis υπομονάδα, παρατηρήθηκε όταν αντικαταστάθηκε ο καρβοξυτελικός επίτοπος των έξι αμινοξικών καταλοίπων ιστιδίνης από τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG (α4-cysloop-ECD-FLAG).
Στα πειράματα συνέκφρασης, των δύο υπομονάδων στο ζυμομύκητα P. pastoris που ακολούθησαν, αρχικά πιστοποιήθηκε η συνέκφραση και στη συνέχεια ο σχηματισμός ετεροπολυμερούς των δύο υπομονάδων. Ακόμα, η απογλυκοζυλίωση των α4-cysloop-ECD-FLAG και β2-cysloop-ECD-6xHis όταν εκφράζονται μόνες τους ή όταν εκφράζονται ταυτόχρονα στο υπερκείμενο του P. pastoris, φανέρωσε την αύξηση της ομοιογένειας των μορίων τους. Επιπλέον, ενθαρυντική ήταν η εύρεση της επιθυμητής στοιχειομετρίας 2 α4/ 3 β2 των υπομονάδων βάση της οποίας συμμετέχουν στο σχηματισμό του ετεροπολυμερούς.
Ωστόσο, η μάζα του ετεροπολυμερούς των ανασυνδιασμένων α4 και β2 υπομονάδων, όπως προέκυψε από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης (1191 και 496kDa), απέχει κατά πολύ από την θεωρητικά αναμενόμενη μάζα ετεροπενταμερούς των 175kDa. Μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός σε δείγματα του απομονωμένου ετεροπολυμερούς, επιβεβαίωσαν το παραπάνω αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα της μελέτης μείωσης του μεγέθους των ετεροπολυμερών με απορρυπαντικά, έδειξαν ότι είναι δυνατή η επιθυμητή μείωση του μεγέθους αλλά σε υψηλές τιμές συγκεντρώσεων απορρυπαντικού. Επιπλέον, η ανάγκη για ακόμα υψηλότερες τιμές απορρυπαντικών προς βελτίωση της ομοιογένειας δεν συνίσταται, διότι κατευθύνει τους σχηματισμούς των πρωτεϊνικών μοριών σε ασταθείς καταστάσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από ευμετάβλητες διαμορφώσεις και πολλές φορές καταστροφή των υπό μελέτη πρωτεϊνών.
Ακόμα, το γεγονός ότι τα απομονωμέμενα ετεροπολυμερή των α4 και β2 ECDs δεν εμφανίζουν την ικανότητα δέσμευσης νικοτίνης, σε συνδιασμό με τα παραπάνω αποτελέσματα μελέτης τους, οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι δεν τηρούν τις προϋποθέσεις των κατάλληλων πρωτεϊνικών δειγμάτων τα οποία προορίζονται για πειράματα μελέτης της δομής τους.
Η έκφραση της ανασυνδιασμένης α1-ECD με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό της άκρο (α1-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση υδατοδιαλυτού και λειτουργικού μορίου. Οι πληροφορίες των μελετών κυκλικού διχρωισμού σε δείγμα της απομονωμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, δείχνουν ότι πρόκειται για ένα μόριο με διαμόρφωση και μάλιστα, σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής, εμφανίζει ένα πλούσιο περιεχόμενο β-πτυχωτής επιφάνειας (40,9%). Ωστόσο, οι δοκιμές κρυστάλλωσης στις οποίες τέθηκαν δείγματα της α1-ECD-6xHis, δεν απέδωσαν το επιθυμητό αποτέλεσμα της κρυστάλλωσης του μορίου. Ακόμα και όταν πραγματοποιήθηκε προσπάθεια μελέτης του μορίου σε διαλύματα (NH4)2SO4 με μεταβλητή συγκέντρωση, pH και θερμοκρασία, στάθηκε αδύνατο να κρυσταλλωθεί το μόριο. Το πρόβλημα της συγκεκριμένης έκφρασης, εντοπίστηκε επιπλέον και στο ποσό της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης που είναι δυνατόν να απομονωθεί. Για να αυξηθεί το επίπεδο έκφρασης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα μεταβολής των συνθηκών καλλιέργειας (θερμοκρασία, σύσταση θρεπτικού μέσου) όπως επίσης και των συνθηκών απομόνωσης. Παρατηρήθηκε βελτίωση στην ποσότητα του τελικού απομονωμένου προϊόντος η οποία όμως δεν θεωρείται ικανοποιητική.
Για το λόγο αυτό, στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έκφραση και απομόνωση της α1-ECD με τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG στο αμινοτελικό της άκρο, στο υπερκείμενο καλλιέργειας του ίδιου ζυμομύκητα. Το επίπεδο έκφρασης της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, ήταν αρκετά ικανοποιητικό (1mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας) και μάλιστα αυξημένο κατά πολύ σε σχέση με τις προηγούμενες εκφράσεις (0,34mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας). Ωστόσο, η αδυναμία ορθής λήψης φάσματος του μορίου μέσω κυκλικού διχρωισμού εξαιτίας αυξημένου θορύβου, στάθηκε η αιτία να σταματήσει η έκφραση της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης. / Nicotinic acetylcholine receptors are homo- or heteropentameric transmembrane glycoproteins which form ion channels and contribute to the function of muscles and neurons. The involvement of these receptors in pathological situations, imposes the knowledge of their structure for the development of specific therapeutic approaches.
Till now, there is not sufficient knowledge about the structure of the human acetylcholine receptor through x-ray crystallography or through NMR experiments. The absence of these data, comes from the nature of the receptor molecules such as the existence of hydrophobic transmembrane domains, the size of the molecule.
Therefore, it is necessary to obtain hydrophilic and functional protein molecules with native-like structure and in adequate quantities in order to be possible structural studies of these molecules. So, the most suitable domains of the acetylchlonine receptors to be used for these studies, are the extracellular domains.
At the beginning, studies of extracellular domains of α4 and β2 subunits with different tags were accomplished in order to choose the best combination to be used in cooexpression experiments in Pichia Pastoris. The expression of the extracellular domains of α4 and β2 tagged with 6xHis in the C-terminus (α4-ECD-6xHis and β2-ECD-6xHis) to the supernatant of the P. pastoris culture, gave very little amounts of protein aggregates which are not suitable for structural studies because of their hydrophobicity. When the hydrophobic region between Cys 128 and Cys 142 was changed with the respective hydrophilic region from Acetylcholine Binding Protein, an increase of expression of the β2-ECD subunit and a decrease of protein aggregation was observed. However, a similar improvement for α4-cysloop-ECD-6xHis subunit was observed after substitution of 6xHis tag with FLAG tag.
Thereafter, the cooexpression experiments through P. pastoris, showed the formation of an heteropolymer which is formed by the two different subunits. Moreover, the in vitro deglycosylation of α4-cysloop-ECD-FLAG and β2-cysloop-ECD-6xHis, either they are coexpressed or not, revealed an improvement of homogeneity of these molecules. Besides these results, the determination of the desirable stoichiometry 2 α4/ 3 β2 of the subunits that participate in the heteropolymer, was also encouraging.
However, the estimation of protein mass of the α4β2 heteropolymer, through gel filtration chromatography (1191 and 496 kDa), showed that these formations are much bigger than the expected mass of heteropentamers. This result is also confirmed by dynamic light scattering experiments. The results from decreasing the size of heteropolymers in the presence of detergents, showed that this is possible to be achieved in high concentrations of detergents with the danger of denaturing the protein molecules. So, it was obvious that this strategy for studying the structure of the extracellular domain of α4β2 receptors, had to be changed.
The expression of the extracellular domain of α1 subunit tagged with 6xHis to the supernatant of P. pastoris culture, led to the isolation of water soluble and functional molecule. Data from circular dicroism studies in a protein sample, showed that α1-ECD has a formation rich in β-sheets (40.9%). However, crystallization trials in samples of α1-ECD-6xHis, gave no protein crystals. Moreover, the yield of the purified protein was too small. In order to achieve an increase of the protein yield, experiments of modifying the temperature and the composition of nutrient were carried out. The result from these experiments showed a slight improvement for the final quantity of protein that is obtained but not satisfactory.
For this reason, there were performed expression and isolation of the extracellular domain of α1 subunit with a FLAG tag in the N-terminus, to the supernatant of P. pastoris culture. The quantity of purified protein was dramatically increased (1mg protein/lt of culture supernatant). However, it was not possible to obtain a circular dichroism spectrum without background noise and that was the reason for not continuing the expression of this protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/616 |
| Date | 08 November 2007 |
| Creators | Στεργίου, Χρήστος |
| Contributors | Τζάρτος, Σωκράτης, Stergiou, Christos, Τζάρτος, Σωκράτης, Σπυρούλιας, Γεώργιος, Πουλάς, Κωνσταντίνος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0058 seconds