Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης, επιτελεί καθοριστικό ρόλο στη σωστή λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Η δυσλειτουργία του υποδοχέα είναι υπεύθυνη για την εκδήλωση της βαριάς μυασθένειας, η οποία αποτελεί αυτοάνοσο νόσημα. Η αποκάλυψη της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα αποτελεί βασική προϋπόθεση στην κατανόηση της λειτουργίας και του ρόλου του στη δημιουργία της βαριάς μυασθένειας. Καθώς όμως, ο υποδοχέας είναι ένα σχετικά μεγάλο μόριο, με αρκετές υδρόφοβες περιοχές, η λύση της τρισδιάστατης δομής του καθίσταται δύσκολη. Τα μόνα δεδομένα που διαθέτουμε προέρχονται από μελέτες του AChR του ελασματοβράγχιου Torpedo californica, ο οποίος παρουσιάζει ικανοποιητική συγγένεια με τον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, και από μελέτες κρυσταλλογραφίας μια πρωτεΐνης του σαλιγκαριού Lymnaea stragnalis, ικανής να δεσμεύει ακετυλοχολίνη (AChBP), η οποία όμως παρουσιάζει μικρή ομοιότητα με τον ανθρώπινο μυϊκό υποδοχέα. Για την αντιμετώπιση των παραπάνω δυσκολιών, εκφράστηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα (extracellular domain: ECD) των β και δ υπομονάδων του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης της Pichia pastoris. Οι δύο υπομονάδες κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλους φορείς έκφρασης, pPIC9 και pPICZaA. Τα ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια που απομονώθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για λειτουργικές μελέτες στα πλαίσια θεραπευτικών προσεγγίσεων και την ολοκλήρωση των μελετών σχετικά με την εξωκυτταρική περιοχή του AChR. Από τα πειραματικά δεδομένα που προέκυψαν, διαπιστώθηκε ότι η εξωκυτταρική περιοχή της β υπομονάδας, εκφράζεται σε διμερή μορφή και σε μεγαλύτερες ποσότητες συγκρινόμενη με τα ECDs των υπολοίπων υπομονάδων που εκφράστηκαν στο ίδιο σύστημα. Το πολυπεπτίδιο αυτό, διαθέτει παράλληλα και την ικανότητα να απομονώνει αντισώματα από ορούς μυασθενικών, από ορισμένους εκ των οποίων τα ποσοστά έφταναν και το 98%. Η διαδικασία απομόνωσης αντισωμάτων βασίζεται στην ακινητοποίηση των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων σε στήλη σεφαρόζης και χρήση της για αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων έναντι της αντίστοιχης υπομονάδας. Στην περίπτωση της δ υπομονάδας τα αποτελέσματα που προέκυψαν από αντίστοιχες μελέτες δεν ήταν τα αναμενόμενα. Συγκεκριμένα, αν και η πρωτεΐνη απομονώνεται σε διαλυτή μορφή, δημιουργεί συσσωματώματα, τα οποία δεν επιτρέπουν τη χρήση της για δομικές μελέτες. Παράλληλα, οι ποσότητες που προκύπτουν είναι μικρές και δεν διευκολύνουν οποιαδήποτε χρήση της πρωτεΐνης. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, αντικαταστάθηκε η θηλιά του εξωκυτταρικού τμήματος της πρωτεΐνης με αυτή της AChBP, η οποία όπως έχει δειχθεί και στο παρελθόν σε άλλες υπομονάδες, βελτίωνε την ποιότητα και την ποσότητα της εκφραζόμενης πρωτεΐνης. Με αυτόν τον τρόπο η διαλυτότητα, καθώς και η ποσότητα, της απομονωμένης πρωτεΐνης αυξήθηκαν. Τα πειράματα ανοσοπροσροφήσεων όμως στην περίπτωση της δ υπομονάδας, δεν επέφεραν κάποιο σημαντικό αποτέλεσμα συγκρινόμενο με τα αντίστοιχα αποτελέσματα ανοσοπροσροφήσεων με τα ECDs των υπολοίπων υπομονάδων του μυϊκού AChR, τουλάχιστον για τους ορούς που ελέγχθηκαν. Εντοπίστηκε όμως ένας ορός, ο οποίος δεν αποκλύει την πιθανότητα εύρεσης κι άλλων θετικών αντι-δ ορών. Από όλα τα παραπάνω δεδομένα, προκύπτει ότι η εξωκυτταρική περιοχή της β υπομονάδας μπορεί να χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια θεραπευτικών προσεγγίσεων και πιθανότατα και σε δομικές μελέτες, σε αντίθεση με τη δ, η οποία στη συγκεκριμένη μορφή δεν παρουσιάζεται κατάλληλη για δομικές μελέτες, καθώς οι παραγόμενες ποσότητες αποτρέπουν κάθε δυνατή προσπάθεια, δίχως όμως να μπορεί να αποκλειστεί η συμβολή της και σε μελλοντικά θεραπευτικά συστήματα. / -

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι ομο- ή ετεροπενταμερείς διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες, σχηματίζοντας ιοντικά κανάλια, συμβάλλουν στην λειτουργία του μυικού και νευρικού συστήματος. Η επικείμενη εμπλοκή των υποδοχέων αυτών σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του οργανισμού, επιβάλλει τη γνώση της δομής τους, απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη εξειδικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Μέχρι τώρα, δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του μορίου του ανθρώπινου υποδοχέα μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ή μέσω πειραμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η απουσία των συγκεκριμένων πληροφοριών, οφείλεται στη φύση του μορίου του υποδοχέα όπως η ύπαρξη των υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών, το μέγεθος του μορίου καθώς και η αδυναμία απομόνωσης σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια υδατοδιαλυτά, λειτουργικά, με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωσή τους και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Τα τμήματα του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία συγκεντρώνουν τις παραπάνω προϋποθέσεις, είναι τα εξωκυτταρικά αμινοτελικά πολυπεπτίδια των διαφόρων υπομονάδων που τον αποτελούν. Από την άλλη πλευρά, ο οργανισμός που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως σύστημα ετερόλογης έκφρασης, πρέπει να είναι εύκολος στους χειρισμούς του, γρήγορος, οικονομικός, με μεγάλο επίπεδο έκφρασης (όπως τα βακτήρια π.χ. E.coli) αλλά ταυτόχρονα να έχει την ικανότητα να πραγματοποιεί μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες που εκφράζει ώστε τα παραγόμενα μόρια να μπορούν να αναδιπλωθούν (όπως τα ευκαρυωτικά κύτταρα). Άρα, για να προκύψουν τα επιθυμητά μόρια, σύμφωνα με τις παραπάνω προϋποθέσεις, εκφράστηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα (ECDs) των ανθρώπινων υπομονάδων α1, α4 και β2 στο υπερκείμενο καλλιέργειας του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα P. pastoris. Αρχικά, μελετήθηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα των α4 και β2 υπομονάδων με διαφορετικούς επιτόπους ώστε να γίνει η επιλογή του καλύτερου συνδιασμού που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για έκφραση των δύο υπομονάδων στο ίδιο σύστημα. Η έκφραση των α4 και β2 ECDs με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό τους άκρο (α4-ECD-6xHis και β2-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση μικρών ποσοτήτων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων τα οποία κρίνονται ακατάλληλα για δομικές μελέτες εξαιτίας της υδροφοβικότητας και κατά συνέπεια του μεγέθους τους. Όταν πραγματοποιήθηκε αλλαγή της υδρόφοβης περιοχής μεταξύ των κυστεινών 128 και 142 με την αντίστοιχη υδρόφιλη ολιγοπεπτιδική αλληλουχία της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη (AChBP) στις ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες, παρατηρήθηκε αισθητή βελτίωση για την β2-ECD υπομονάδα (β2-cysloop-ECD-6xHis) τόσο σε επίπεδο έκφρασης όσο και στο μέγεθος το οποίο σχηματίζει. Ωστόσο, παρόμοια βελτίωση για την α4-cysloop-ECD-6xHis υπομονάδα, παρατηρήθηκε όταν αντικαταστάθηκε ο καρβοξυτελικός επίτοπος των έξι αμινοξικών καταλοίπων ιστιδίνης από τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG (α4-cysloop-ECD-FLAG). Στα πειράματα συνέκφρασης, των δύο υπομονάδων στο ζυμομύκητα P. pastoris που ακολούθησαν, αρχικά πιστοποιήθηκε η συνέκφραση και στη συνέχεια ο σχηματισμός ετεροπολυμερούς των δύο υπομονάδων. Ακόμα, η απογλυκοζυλίωση των α4-cysloop-ECD-FLAG και β2-cysloop-ECD-6xHis όταν εκφράζονται μόνες τους ή όταν εκφράζονται ταυτόχρονα στο υπερκείμενο του P. pastoris, φανέρωσε την αύξηση της ομοιογένειας των μορίων τους. Επιπλέον, ενθαρυντική ήταν η εύρεση της επιθυμητής στοιχειομετρίας 2 α4/ 3 β2 των υπομονάδων βάση της οποίας συμμετέχουν στο σχηματισμό του ετεροπολυμερούς. Ωστόσο, η μάζα του ετεροπολυμερούς των ανασυνδιασμένων α4 και β2 υπομονάδων, όπως προέκυψε από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης (1191 και 496kDa), απέχει κατά πολύ από την θεωρητικά αναμενόμενη μάζα ετεροπενταμερούς των 175kDa. Μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός σε δείγματα του απομονωμένου ετεροπολυμερούς, επιβεβαίωσαν το παραπάνω αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα της μελέτης μείωσης του μεγέθους των ετεροπολυμερών με απορρυπαντικά, έδειξαν ότι είναι δυνατή η επιθυμητή μείωση του μεγέθους αλλά σε υψηλές τιμές συγκεντρώσεων απορρυπαντικού. Επιπλέον, η ανάγκη για ακόμα υψηλότερες τιμές απορρυπαντικών προς βελτίωση της ομοιογένειας δεν συνίσταται, διότι κατευθύνει τους σχηματισμούς των πρωτεϊνικών μοριών σε ασταθείς καταστάσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από ευμετάβλητες διαμορφώσεις και πολλές φορές καταστροφή των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Ακόμα, το γεγονός ότι τα απομονωμέμενα ετεροπολυμερή των α4 και β2 ECDs δεν εμφανίζουν την ικανότητα δέσμευσης νικοτίνης, σε συνδιασμό με τα παραπάνω αποτελέσματα μελέτης τους, οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι δεν τηρούν τις προϋποθέσεις των κατάλληλων πρωτεϊνικών δειγμάτων τα οποία προορίζονται για πειράματα μελέτης της δομής τους. Η έκφραση της ανασυνδιασμένης α1-ECD με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό της άκρο (α1-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση υδατοδιαλυτού και λειτουργικού μορίου. Οι πληροφορίες των μελετών κυκλικού διχρωισμού σε δείγμα της απομονωμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, δείχνουν ότι πρόκειται για ένα μόριο με διαμόρφωση και μάλιστα, σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής, εμφανίζει ένα πλούσιο περιεχόμενο β-πτυχωτής επιφάνειας (40,9%). Ωστόσο, οι δοκιμές κρυστάλλωσης στις οποίες τέθηκαν δείγματα της α1-ECD-6xHis, δεν απέδωσαν το επιθυμητό αποτέλεσμα της κρυστάλλωσης του μορίου. Ακόμα και όταν πραγματοποιήθηκε προσπάθεια μελέτης του μορίου σε διαλύματα (NH4)2SO4 με μεταβλητή συγκέντρωση, pH και θερμοκρασία, στάθηκε αδύνατο να κρυσταλλωθεί το μόριο. Το πρόβλημα της συγκεκριμένης έκφρασης, εντοπίστηκε επιπλέον και στο ποσό της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης που είναι δυνατόν να απομονωθεί. Για να αυξηθεί το επίπεδο έκφρασης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα μεταβολής των συνθηκών καλλιέργειας (θερμοκρασία, σύσταση θρεπτικού μέσου) όπως επίσης και των συνθηκών απομόνωσης. Παρατηρήθηκε βελτίωση στην ποσότητα του τελικού απομονωμένου προϊόντος η οποία όμως δεν θεωρείται ικανοποιητική. Για το λόγο αυτό, στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έκφραση και απομόνωση της α1-ECD με τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG στο αμινοτελικό της άκρο, στο υπερκείμενο καλλιέργειας του ίδιου ζυμομύκητα. Το επίπεδο έκφρασης της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, ήταν αρκετά ικανοποιητικό (1mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας) και μάλιστα αυξημένο κατά πολύ σε σχέση με τις προηγούμενες εκφράσεις (0,34mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας). Ωστόσο, η αδυναμία ορθής λήψης φάσματος του μορίου μέσω κυκλικού διχρωισμού εξαιτίας αυξημένου θορύβου, στάθηκε η αιτία να σταματήσει η έκφραση της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης. / Nicotinic acetylcholine receptors are homo- or heteropentameric transmembrane glycoproteins which form ion channels and contribute to the function of muscles and neurons. The involvement of these receptors in pathological situations, imposes the knowledge of their structure for the development of specific therapeutic approaches. Till now, there is not sufficient knowledge about the structure of the human acetylcholine receptor through x-ray crystallography or through NMR experiments. The absence of these data, comes from the nature of the receptor molecules such as the existence of hydrophobic transmembrane domains, the size of the molecule. Therefore, it is necessary to obtain hydrophilic and functional protein molecules with native-like structure and in adequate quantities in order to be possible structural studies of these molecules. So, the most suitable domains of the acetylchlonine receptors to be used for these studies, are the extracellular domains. At the beginning, studies of extracellular domains of α4 and β2 subunits with different tags were accomplished in order to choose the best combination to be used in cooexpression experiments in Pichia Pastoris. The expression of the extracellular domains of α4 and β2 tagged with 6xHis in the C-terminus (α4-ECD-6xHis and β2-ECD-6xHis) to the supernatant of the P. pastoris culture, gave very little amounts of protein aggregates which are not suitable for structural studies because of their hydrophobicity. When the hydrophobic region between Cys 128 and Cys 142 was changed with the respective hydrophilic region from Acetylcholine Binding Protein, an increase of expression of the β2-ECD subunit and a decrease of protein aggregation was observed. However, a similar improvement for α4-cysloop-ECD-6xHis subunit was observed after substitution of 6xHis tag with FLAG tag. Thereafter, the cooexpression experiments through P. pastoris, showed the formation of an heteropolymer which is formed by the two different subunits. Moreover, the in vitro deglycosylation of α4-cysloop-ECD-FLAG and β2-cysloop-ECD-6xHis, either they are coexpressed or not, revealed an improvement of homogeneity of these molecules. Besides these results, the determination of the desirable stoichiometry 2 α4/ 3 β2 of the subunits that participate in the heteropolymer, was also encouraging. However, the estimation of protein mass of the α4β2 heteropolymer, through gel filtration chromatography (1191 and 496 kDa), showed that these formations are much bigger than the expected mass of heteropentamers. This result is also confirmed by dynamic light scattering experiments. The results from decreasing the size of heteropolymers in the presence of detergents, showed that this is possible to be achieved in high concentrations of detergents with the danger of denaturing the protein molecules. So, it was obvious that this strategy for studying the structure of the extracellular domain of α4β2 receptors, had to be changed. The expression of the extracellular domain of α1 subunit tagged with 6xHis to the supernatant of P. pastoris culture, led to the isolation of water soluble and functional molecule. Data from circular dicroism studies in a protein sample, showed that α1-ECD has a formation rich in β-sheets (40.9%). However, crystallization trials in samples of α1-ECD-6xHis, gave no protein crystals. Moreover, the yield of the purified protein was too small. In order to achieve an increase of the protein yield, experiments of modifying the temperature and the composition of nutrient were carried out. The result from these experiments showed a slight improvement for the final quantity of protein that is obtained but not satisfactory. For this reason, there were performed expression and isolation of the extracellular domain of α1 subunit with a FLAG tag in the N-terminus, to the supernatant of P. pastoris culture. The quantity of purified protein was dramatically increased (1mg protein/lt of culture supernatant). However, it was not possible to obtain a circular dichroism spectrum without background noise and that was the reason for not continuing the expression of this protein.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs), μέλη της υπερ-οικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων ιοντικών καναλιών (LGICs), είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, διακρίνονται σε μυϊκού και νευρικού τύπου υποδοχείς. Οι μυϊκού τύπου nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα των ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις των σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μύες. Αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες που σχηματίζουν ένα κανάλι, με στοιχειομετρία (α1)2βγδ στα έμβρυα ή (α1)2βεδ στους ενήλικες. Κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (α) ένα αμινο-τελικό εξωκυτταρικό τμήμα (ECD) μήκους ~210–220 αμινοξέων (β) τέσσερις μικρές (15–20 αμινοξέα μήκος η καθεμιά) υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (M1–M4) και δύο μικρές υδρόφοβες θηλιές, μεταξύ των M1–M2 και M2–M3 (γ) μια υδρόφιλη κυταρροπλασματική θηλιά που ποικίλει σε μέγεθος (100–150 κατάλοιπα) και αμινοξική σύσταση μεταξύ των υπομονάδων, ανάμεσα στην Μ3 και Μ4 περιοχή, και (δ) ένα μικρό (4–28 αμινοξέα) υδρόφιλο καρβοξυ-τελικό άκρο εξωκυτταρικά. Οι μυϊκού τύπου nAChRs εκτός από την φυσιολογική τους δράση εμπλέκονται και στην αυτοάνοση νόσο μυασθένεια (myasthenia gravis-MG). Τα αυτοαντισώματα των μυασθενικών προσδένονται στην εξωκυτταρική περιοχή του AChR και η πλειοψηφία τους φαίνεται να στοχεύει την α1 υπομονάδα και συγκεκριμένα την κύρια ανοσογόνο περιοχή της-MIR. Επιπλέον, στην εξωκυτταρική περιοχή της α1 υπομονάδας εντοπίζεται και η περιοχή που συμμετέχει στον σχηματισμό της θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και άλλων χολινεργικών προσδετών. Το α1 ECD του ανθρώπινου nAChRs έχει ήδη εκφραστεί, απομονωθεί και χαρακτηριστεί από υπερκείμενο καλλιέργειας του ζυμομύκητα Pichia pastoris ως μονομερές, υδατοδιαλυτό και λειτουργικό πρωτεϊνικό μόριο. Η ικανότητά του να προσδένει αντι-AChR αυτοαντισώματα βρέθηκε μέτρια, και για τον λόγο αυτό στην παρούσα εργασία εκφράστηκε σε ένα ανώτερο εξελικτικά σύστημα από αυτό του Pichia pastoris, με σκοπό την έκφραση μορίων με καλύτερη αναδίπλωση, που να προσομοιάζουν περισσότερο με την φυσική τους διαμόρφωση, καθώς επίσης και την παραγωγή ικανοποιητικής ποσότητας πρωτεΐνης, ώστε να είναι εφικτή η δομική της μελέτη. Ως ετερόλογο σύστημα έκφρασης, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα εντόμων του είδους Trichoplusia ni (High Five), τα οποία ήταν σταθερά μετασχηματισμένα ως προς το ανασυνδιασμένο α1 ECD πολυπεπτίδιο. Αναλυτικότερα, το ECD της α1 υπομονάδας εκφράστηκε στα δύο συστήματα και στην συνέχεια καθαρίστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακής διήθησης. Το High Five α1 ECD εκφράστηκε ως υδατοδιαλυτό μόριο σε ικανοποιητική ποσότητα ενώ η χρωματογραφία μοριακής διήθησης και οι μελέτες δυναμικής σκέδασης του φωτός έδειξαν επιπλέον πως εκφράζεται ως μονομερές. Ορισμένοι χολινεργικοί προσδέτες προσδένονται στο High Five α1 ECD, επιβεβαιώνοντας πως η διαμόρφωσή του προσομοιάζει με του ανθρώπινου nAChR. Με πειράματα ELISA και ραδιοανοσολογικού προσδιορισμού, προέκυψε πως το High Five α1 ECD δεσμεύει μεγαλύτερο ποσοστό αντι-nAChR μονοκλωνικών αντισωμάτων και αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενικών, συγκριτικά με το Pichia pastoris α1 ECD. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, το ανασυνδυασμένο α1 ECD του ανθρώπινου nAChR, εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων High Five, προσομοιάζει περισσότερο με την φυσική διαμόρφωση του nAChR. Επιπλέον, το ετερόλογο σύστημα έκφρασης των High Five κυττάρων είναι αποδοτικά καλύτερο σε σύγκριση με αυτό του ζυμομύκητα Pichia pastoris. Αυτό, καθιστά το High Five α1 ECD καταλληλότερο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, που θα βοηθήσουν στην επίλυση της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα, αλλά και για την ανάπτυξη μιας ειδικής αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), members of the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), are transmembrane glycoproteins (Mr ~290 kDa). According to their topology and their pharmacological properties, nAChRs are divided into muscle-type and neuronal-type nAChRs. The muscle-type AChRs are located in fish electric organs as well as in the neuromuscular junction, where they transmit electrical signals from the nervous system to the vertebrate skeletal muscles. They consist of five homologous subunits forming a channel with stoichiometry (α1)2βγδ in embryos or (α1)2βεδ in adults. A nAChR subunit consists of: (a) a N-terminal extracellular domain (ECD) which is ~210–220 amino acids long; (b) four short (15–20 amino acids long) hydrophobic transmembrane segments (M1–M4) and two small hydrophilic loops, linking segments M1–M2 and M2–M3; (c) a hydrophilic cytoplasmic loop varying in size (100–150 residues) and sequence among different type of subunits, which located between M3 and M4 segment, and (d) a C-terminal short (4–28 amino acids) hydrophilic extracellular segment end. Muscle type nAChRs are also involved in the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). Αutoantibodies in MG bind to the extracellular domain of the AChR and their majority target the α1 subunit and more specific the major immunogenic region (MIR). Moreover, the ECD of the α1 subunit bears the binding sites for acetylcholine and other cholinergic ligands. The human nAChR α1 subunit ECD has been expressed, isolated and characterized in the yeast Pichia pastoris as a monomer, water-soluble and functional molecule, with a medium ability to bind antibodies against AChR. In this project, the human nAChR α1 subunit ECD was expressed in an evolutionary higher protein expression system compared to Pichia pastoris system, in order to express molecules with better conformation, close to that of the native protein and to produce considerable amounts of protein for structural studies. In more details, we have used insect cells from the species Trichoplusia ni (High Five), which were stably transformed with the α1 ECD polypeptide. The α1 ECD of the human muscle nAChR, was expressed in both systems and was isolated and purified by affinity chromatography and fast protein liquid chromatography analysis (FPLC). The recombinant High Five α1 ECD was expressed as a water-soluble molecule in sufficient quantities. FPLC and dynamic light scattering analysis determined it to be monomer. Several cholinergic ligands were found to bind to High Five α1 human ECD confirming the native-like conformation of the protein. High Five α1 ECD was subsequently found to bind better conformation-dependent anti-nAChR mAbs than the Pichia pastoris α1 human ECD, as determined by ELISA and radioimmunoassay analysis. The binding of High Five α1 human ECD to anti-nAChR autoantibodies from MG patients, was also found to be better than the Pastoris pastoris α1 human ECD. These results indicate that the recombinant α1 human ECD, expressed in High Five cells, has a more native-like conformation than Pichia pastoris α1 ECD, being suitable for high resolution structural studies, in order to reveal the structure of the human nAChR and for the development of an antigen specific therapy for MG.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης είναι ο σημαντικότερος στόχος στην αυτοάνοση νόσο βαριά μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (85%) ανιχνεύονται αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε διαταραχή της μεταγωγής του κινητικού ερεθίσματος. Σε αυτή την μελέτη στόχος είναι η κατασκευή και έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων α και β του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε κύτταρα εντόμων μετά από επιμόλυνση με βακιλοϊό. Στα ίδια πλαίσια πραγματοποιήθηκε η σύνδεση των υπομονάδων α και β με πεπτιδικό συνδέτη για την δημιουργία του συγκαταμερούς β-α. Τα ανασυνδυασμένα αυτά πεπτίδια απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν σε διαλυτή μορφή. Σε επόμενο στάδιο έγινε η ακινητοποίηση τους σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ο έλεγχος της ικανότητας πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορό μυασθενών με απώτερο στόχο τηv χρήση τους ως πιθανοί ανοσοπροσροφητές σε μια καινούρια θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια. / Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease caused in the majority of patients (85%) by autoantibodies against the human muscle acetylcholine receptor (AChR),a post-synaptic ligand-gated ion-channel located at the neuromuscular junction.Autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs leading to muscle weakness and fatigability.An attractive therapeutic approach is the extracorporeal specific removal of the pathogenic autoantibodies using AChR-based immunoadsorbents. In this study, the N-terminal extracellular domains (ECD) of AChR the subunits α1 and β1 were cloned into baculovirus expression vectors and heterologously expressed using insect SF9 cells.Additionally, the two subunits were linked by the use of a flexible peptide linker to form the β1-α1 concatamer.The recombinant proteins were expressed as soluble polypeptides, purified and characterized.Furthermore, they were immobilised on sepharose beads in order to test them as immunoadsorbents using sera from MG patients. They were all found to bind anti-AChR autoantibodies, albeit to varying degrees. They, thus, pose as potential candidates for the therapeutic antigen-specific clearance of MG sera.

Η συμμετοχή της γενετικής, έναντι της περιβαλλοντικής επίδρασης στη συμπεριφορά αποτελεί θεμελιώδες ερώτημα για τις νευροεπιστήμες και αποτελεί πεδίο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος. Η σεξουαλικότητα είναι μια σύνθετη αλληλεπίδραση πολλαπλών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων ανατομικών, φυσιολογικών, ψυχολογικών, αναπτυξιακών, πολιτιστικών και σχεσιακών παραγόντων. Παρά την υψηλή συχνότητα εμφάνισης της γυναικείας σεξουαλικής δυσλειτουργίας, λιγότερη έμφαση έχει δοθεί στη μελέτη της από την επιστημονική κοινότητα. Το βιολογικό και ψυχολογικό υπόβαθρό της παραμένει ένα υποσχόμενο πεδίο έρευνας καθώς οι διαθέσιμες θεραπείες είναι πολύ λιγότερες συγκριτικά με την ανδρική σεξουαλική δυσλειτουργία. Η σεξουαλική λειτουργία των γυναικών έχει μελετηθεί κατά καιρούς στο σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών, λαμβάνοντας υπόψη ερωτηματολόγια σεξουαλικής δραστηριότητας και επίπεδα φυλετικών ορμονών αλλά όχι τους γενετικούς πολυμορφισμούς που μπορεί να εμπλέκονται και να δημιουργούν συγκεκριμένο βιολογικό υπόβαθρο. Η αλληλεπίδραση ορμονών, νευροδιαβιβαστών και περιβαλλοντικών παραγόντων είναι ευρέως αποδεκτή στη διαμόρφωση του υποστρώματος της γυναικείας σεξουαλικότητας αλλά οι τρόποι παραμένουν ακόμα ασαφείς. Για το λόγο αυτό, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η συσχέτιση των πολυμορφισμών του ανδρογονικού υποδοχέα και του υποδοχέα της βαζοπρεσίνης με τη γυναικεία σεξουαλικότητα στις γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών. Η επίδραση των ανδρογόνων στη γυναικεία σεξουαλικότητα αποτελεί πεδίο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος καθώς οι μηχανισμοί αλληλεπίδρασης είναι ιδιαίτερα πολύπλοκοι. Τα ανδρογόνα ασκούν τη δράση τους μέσω πρόσδεσης και ενεργοποίησης των ανδρογονικών υποδοχέων. Το γονίδιο του υποδοχέα των ανδρογόνων αποτελείται από δύο μοτίβα πολυμορφικών επαναλήψεων CAG & GGN που κωδικοποιούν ποικίλου μήκους πολυγλουταμινικών και πολυγλυκινικών περιοχών αντίστοιχα. Έχει επίσης φανεί ότι το αυξημένο μήκος της CAG επαναληπτικής αλληλουχίας πιθανόν να σχετίζεται με μειωμένη δραστικότητα του AR και ως εκ τούτου και με διαταραχές που σχετίζονται με μειωμένη δράση ανδρογόνων Διάφορα νευροπεπτίδια όπως η βαζοπρεσίνη, η αδενοκορτικοτροπίνη, η ωκυτοκίνη κ.α. επιδρούν στην ενήλικο σεξουαλική συμπεριφορά διαφόρων οργανισμών. Η βαζοπρεσίνη και ο υποδοχέας της αποτέλεσαν αντικείμενο μελέτης για την ερμηνεία της ανθρώπινης κοινωνικής και σεξουαλικής συμπεριφοράς. Οι πολυμορφισμοι του AVPR έχουν επίσης σχετιστεί με αλτρουισμό, με μονογαμία και ανάπτυξη σχέσεων δεσμού, γνώση μουσικής και χορού που αντανακλούν αρχέγονες κοινωνικές αλληλεπιδράσεις όπως ιεροτελεστικές κινήσεις και επικοινωνία μέσω ήχων. Το γονίδιο του υποδοχέα της βαζοπρεσίνης διαθέτει τέσσερα μικροδορυφορικά μοτίβα. Ακολουθώντας τις μελέτες στον αρουραίο του αγρού (vole), η προσοχή έχει κυρίως επικεντρωθεί στις μικροδορυφoρικές επαναλήψεις στην περιοχή του υποκινητή. Πρόκειται για τις RS1 {(GATA)14} και RS3 {(CT)4-TT-(CT)8-(GT)24}, που είναι εξαιρετικά πολυμορφικές. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της συσχέτισης της πολυμορφικής CAG περιοχής του ανδρογονικού υποδοχέα και του RS1 πολυμορφισμού του υποδοχέα της βαζοπρεσίνης με την γυναικεία σεξουαλική συμπεριφορά στο σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών. Για το λόγο αυτό η παρούσα μελέτη συμπεριέλαβε 40 γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών και 94 υγιείς γυναίκες, στις οποίες διενεργήθηκαν ορμονικοί προσδιορισμοί, ψυχομετρικά τεστ για αξιολόγηση της σεξουαλικής λειτουργίας τους και διερεύνηση της συσχέτισης με τα γονοτυπικά τους χαρακτηριστικά (αριθμός επαναλήψεων των πολυμορφικών μοτίβων στα αλληλόμορφά τους). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι στην κατηγορία των γυναικών με PCOS η ενεργότητα του υποδοχέα συσχετίστηκε με μειωμένα επίπεδα oιστρογόνων και με αυξημένη ικανοποίηση, γεγονός που υποδηλώνει ότι σε καθεστώς περίσσειας ανδρογονικού ερεθίσματος η γυναικεία σεξουαλικότητα επάγεται. Επίσης στην ίδια ομάδα γυναικών φάνηκε συσχέτιση μεταξύ των υψηλών επιπέδων FSH και των υψηλών αριθμών επαναλήψεων του RS1 πολυμορφισμού, υποδεικνύοντας έναν κεντρικό ρόλο του AVPR στη ρύθμιση της ωοθυλακιορρηξίας των γυναικών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών. / The contribution of genetic versus environmental influence in behavioral analysis is a fundamental question for neuroscience and it is also an area of strong research interest, Sexuality is distinguished by a complex interaction between anatomic, physiologic, psychological, developmental, relational and cultural factors. Despite the high frequency of sexuality disorders in women, scientists have not placed emphasis on this. The biological and psychological background of women’s sexuality disorder still remains a promising field of research, since the available therapies are fewer than those that are used in male sexual dysfunction. Female sexuality has been studied frequently in women with PCOS and has been based on questionnaires of female’s sexual functionality and serum levels of sex steroid hormones. These studies didn’t take account of the genetic polymorphisms which can be involved in a specific biological background. The interaction of hormones, neurotransmitters and environmental factors is widely accepted in the composition of female’s sexual function but the ways that this interaction happens are still unclear. Thus, the aim of our study was to consider the possible association between the genetic polymorphism of androgen receptor gene and vasopressin receptor gene and female sexuality in women with PCOS. The influence of androgens in female sexuality is a field of intense interest in the scientific community, but the ways this interaction occurs are very complicated. Androgens bind and activate androgen receptors.The androgen receptor gene consists of eight exons and encodes a protein with 919 amino acid residues. Exon 1 of the gene consists of two polymorphic repeat (CAG and GGN) motifs, encoding variable lengths of polyglutamine and polyglycine stretches, respectively. Also, it has been proposed that that the increased length of the CAG repeat should associate with decreased AR activity and hence the disorders related to the reduced androgen actions. Many neuropeptides such as vasopressin, oxytocin, adrenocorticotropic hormone (ACTH) etc, affect sexual behavior in many species. Vasopressin and it’s receptor has been well studied in order to interpret human social and sexual behavior. The genetic polymorphisms of the vasopressin receptor gene has been also associated with altruism, monogamy, pair bonding, musical and dancing ability. The latter reflects primitive social interactions such as ritual movements and vocalization. Vasopressin receptor gene is distinguished by three microsatellites in the 5’ flanking region and a fourth in the single intron. Following the vole studies, attention has been primarily focused on two microsatellites in the promoter region, RS1 {{GATA)14} and RS3 {(CT)4-TT-(CT)8-(GT)24}, which are highly polymorphic. The aim of our study is to investigate the association between the polymorphic CAG region of androgen receptor gene and RS1 polymorphism of vasopressin receptor gene with sexual behavior in women with PCOS. Thus, our study included 40 women with PCOS and 94 healthy women. We performed hormonal analysis, psychometric tests to evaluate their sexual functionality and looked into the association with their genetic characteristics (the number of repeats of polymorphic motifs in their alleles). Our results showed that androgen receptor’s activity is associated with low estrogen levels and high sexual satisfaction in women with PCOS. This indicates that in a state of androgen excess, female sexuality is induced. In the same group of women, we noted an association between high levels of FSH and a high number of repeats of RS1 polymorphism. This suggests a central role of vasopressin receptor in the regulation of ovulation in women with PCOS.

Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή είναι ένα φαινόμενο που πιθανότατα εμπλέκεται στην παθογένεια του καρκίνου του λάρυγγα. Η ΕΜΤ εξελισσόμενη μέσα από δαιδαλώδη μονοπάτια μεταγωγής σήματος καταλήγει να προσδώσει στο καρκινικό κύτταρο δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά που το καθιστούν ικανό να μπορεί να διεισδύει στους ιστούς και να μεθίσταται. Κεντρικό μόριο στα μοριακά μονοπάτια που διαμεσολαβούν την ΕΜΤ στον καρκίνο του λάρυγγα είναι μια κινάση, η ILK, που δέχεται σήματα από τις ιντεγκρίνες και τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Στους επιθηλιακούς καρκίνους αναφέρεται η εμπλοκή της σε λειτουργίες όπως ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, αποφυγή της απόπτωσης, νεοαγγειογένεση, απώλεια των δομών συνοχής του κυττάρου, έκφραση μεταλλοπρωτεασών και αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Στο λαρυγγικό καρκίνο όμως κρίσιμα φαινόμενα για τον μεταστατικό-επιθετικό χαρακτήρα των κυττάρων, όπως, η εξαφάνιση των E-cadherin, η μετακίνηση των β-catenin στον πυρήνα και η συσχέτιση μεταξύ τους, που διαπιστώθηκαν, δεν βρέθηκε να συνδέονται με την υπερέκφραση της ILK καθιστώντας προφανώς άλλους μηχανισμούς υπεύθυνους για την επιτέλεση αυτών των λειτουργιών. Ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα όμως ήταν και η εντόπιση της ILK στον πυρήνα των κυττάρων του καρκίνου του λάρυγγα δίνοντας μια νέα προοπτική στην έρευνα για τον ρόλο της ILK στον καρκίνο. Στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος της ILK στο λαρυγγικό καρκίνο βρέθηκε πως συμμετέχει και η ενεργοποιημένη Akt με την οποία επίσης σχετίζονται πολλές κρίσιμες λειτουργίες για το καρκινικό κύτταρο. Ωστόσο η p-Akt στο λαρυγγικό καρκίνο φαίνεται πως έχει κάποιο ρόλο αντίθετο με την λειτουργία του καρκινικού κυττάρου καθώς χαρακτηρίζει όγκους καλύτερης διαφοροποίησης. Ο λαρυγγικός καρκίνος τέλος διαπιστώθηκε πως χαρακτηρίζεται από την έκφραση υποδοχέων ανδρογόνων και οιστρογόνων καθιστώντας πολύ πιθανό το ρόλο αυτών των μορίων στην παθογένεια της νόσου. Ενδιαφέρουσα για την πιθανότητα εμπλοκής των υποδοχέων στερεοειδών ορμονών του φύλου στην ΕΜΤ ίσως να είναι η συσχέτιση των υποδοχέων ανδρογόνων και οιστρογόνων με την ILK και p-Akt αντίστοιχα. Οι υποδοχείς οιστρογόνων μάλιστα χαρακτηρίζοντας όγκους λάρυγγα αρχικών σταδίων ίσως θα μπορούσε να αποδειχτεί μόριο με προγνωστική αξία αλλά και θεραπευτικός στόχος. Τέλος η μελέτη της έκφρασης της ILK, της p-Akt και των υποδοχέων στεροειδών ορμονών του φύλου δεν ανέδειξε μια διαφορετική έκφραση μεταξύ υπεργλωττιδικών και γλωττιδικών καρκίνων του λάρυγγος ώστε να υποστηρίξει την ύπαρξη ενός μοριακού υποβάθρου στην παρατήρηση της ανόμοιας κλινικής συμπεριφοράς μεταξύ όγκων από τις δύο αυτές ανατομικά διακριτές περιοχές. / Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process possibly implicated in the pathogenesis of laryngeal cancer. EMT is a type of epithelial cell plasticity which is characterized by long lasting phenotypic and molecular modifications of the epithelial cell as a result of a transforming procedure leading to a cell of mesenchymal type. This molecular procedure seems to be pivotal for the metastasis of epithelial cancers and its attribution to the epithelial cells is the gain of structural and functional traits which enable them to invade the tissues and metastaze. In the current study ILK expression, which is a central molecule in the signal transduction pathways of EMT, seems to be implicated in human laryngeal carcinoma. Furthermore, localization of ILK in the nucleus possibly suggests novel nuclear functions of ILK. In addition, enhanced ILK expression in laryngeal carcinoma correlates with activation of Akt. Moreover, while activated Act seems to characterize well differentiated tumors, loss of E-cadherin and activation of β-catenin were correlated with high grade carcinomas. Finally, in laryngeal cancer, mechanisms other than ILK overexpression seem to account for downregulation of E-cadherin and activation of β-catenin. Additionaly this study concluded that estrogen and androgen receptors are expressed in laryngeal carcinomas, indicating their possible role in the pathogenesis of this disease. It is interesting that the receptors of gender-related steroid hormones could have a possible relation to epithelial to mesenchymal transition phenomenon since a correlation between androgen and estrogen receptors with ILK and p-Akt respectively, was revealed. Moreover estrogen receptors characterize primary TMN-stage laryngeal carcinomas. This can be very important as it makes a prospect of using ER as a prognostic factor but even more as a novel hormonal therapy for laryngeal carcinomas. Finally the study of molecules like ILK, p-Akt, estrogen and androgen receptors did not reveal any differentiantal expression between glotic and supraglotic laryngeal carcinomas in order to support the existence of a molecular background, at least as far as those molecules are concerned, to the distinct clinical outcome of those different anatomically-derived laryngeal carcinomas. Metastasis is a rapid development in the ominous course of cancer. The effort to interpret the molecular basis of this phenomenon is not a subject of simple academic interest since the exploit of the molecular mechanisms so as to gain the control of metastasis could be the ‘‘bet’’ for a futuristic ‘‘molecular surgery’’.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChR) αποτελούν πρότυπα μέλη της υπεροικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων διαύλων ιόντων. Εμπλέκονται τόσο σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού, όσο και σε πολλές νόσους προσελκύοντας μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον. Οι nAChR διακρίνονται κυρίως σε νευρικού και μυϊκού τύπου. Ο νευρικός α4β2 nAChR έχει εκφραστεί και μελετηθεί με τεχνικές όπως πρόσδεση αγωνιστών-ανταγωνιστών και ηλεκτροφυσιολογικές αναλύσεις. Όμως δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ, πάνω σε αυτόν τον υποδοχέα δεν έχουν ακόμα αναφερθεί και πιθανή αιτία γι’ αυτό μπορεί να είναι και η ευέλικτη διαμόρφωση της κυτταροπλασματικής θηλιάς μεταξύ των διαμεμβρανικών ελίκων Μ3 και Μ4, η οποία μπορεί να εμποδίζει την ευαίσθητη από τη φύση της διαδικασία της κρυστάλλωσης των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Στην παρούσα μελέτη ο ανθρώπινος α4β2 nAChR εκφράστηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων Sf9 με τη βοήθεια βακιλοϊού, όσο και σε ζυμομύκητες P. pastoris, σε δυο μορφές: Τον άγριου τύπου υποδοχέα (ΑΤ) και μια μορφή χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά (Κ). Στόχος της παρούσης μελέτης, ήταν η έκφραση ενός τύπου α4β2 nAChR με την καλύτερη δυνατή ποιότητα δομής και τα υψηλότερα δυνατά επίπεδα έκφρασης, ο οποίος θα ήταν κατάλληλος να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες υψηλής ανάλυση όπως η κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ. Αρχικά κατασκευάστηκαν ανασυνδυασμένοι βακιλοϊοί με τα cDNA των υπομονάδων των ΑΤ και Κ α4β2 υποδοχέων, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα εντόμων Sf9 αναγκάζοντάς τα να εκφράσουν τους υποδοχείς. Οι υπομονάδες των ΑΤ και Κ υποδοχέων ανιχνεύτηκαν εκφρασμένες σε κύτταρα εντόμων με στύπωμα western σε αναμενόμενα μοριακά βάρη, ενώ με πρόσδεση 125Ι-επιβατιδίνης αποδείχθηκε ότι οι α4 και οι β2 υπομονάδες είχαν ενωθεί μεταξύ τους μετά την έκφρασή τους και είχαν συγκροτήσει λειτουργικούς θύλακες πρόσδεσης ακετυλοχολίνης. Ο βέλτιστος χρόνος έκφρασης των υποδοχέων βρέθηκε να είναι τα 3 24ωρα, ενώ οι ιδανικές αναλογίες α4 προς β2 βακιλοϊών βρέθηκαν να είναι οι: 1:1 και 1:3. Η προσθήκη νικοτίνης στο θρεπτικό δεν βρέθηκε να έχει κάποια μετρήσιμη επίπτωση στην έκφραση ούτε του ΑΤ ούτε και του Κ υποδοχέα. Πειράματα πρόσδεσης 3Η-επιβατιδίνης έδειξαν τη συγγένειά της με τον ΑΤ υποδοχέα να είναι 2 φορές υψηλότερη σε σχέση με τον Κ, ενώ στα ίδια πειράματα βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Κ υποδοχέα ήταν 7 φορές υψηλότερα από αυτά του ΑΤ. Πειράματα πρόσδεσης μη επισημασμένων προσδετών έδωσαν συγγένειες επίσης δυο φορές υψηλότερες για τον ΑΤ υποδοχέα σε σχέση με τον Κ. Επιπλέον πειράματα διαλυτοποίησης έδειξαν ότι οι βέλτιστες συνθήκες για την διαλυτοποίηση των υποδοχέων ήταν οι 25 oC και η χρήση του απορρυπαντικού Triton X-100. Στην ίδια σειρά πειραμάτων ο Κ υποδοχέας βρέθηκε να διαλυτοποιείται 4 φορές πιο αποδοτικά σε σχέση με τον ΑΤ. Τα πειράματα απομόνωσης και καθαρισμού συνεχίστηκαν μόνο με τον Κ υποδοχέα, λόγω καλύτερης διαλυτοποίησης και πολύ υψηλότερων επιπέδων έκφρασης που παρουσίαζε σε σχέση με τον ΑΤ. Ο Κ α4β2 υποδοχέας απομονώθηκε και καθαρίστηκε αρχικά με χρωματογραφία συγγένειας ιόντων νικελίου και στη συνέχεια με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, η οποία έδειξε ότι ο Κ υποδοχέας είχε εκλουστεί σε όγκο έκλουσης συμβατό με το αναμενόμενο ΜΒ. Το γεγονός αυτό, μαζί με το γεγονός της πρόσδεσης επιβατιδίνης και άλλων προσδετών, πιστοποίησαν ότι οι ταυτόχρονα εκφραζόμενες α4 και β2 υπομονάδες συγκρότησαν υποδοχείς. Η ανάλυση του καθαρισμένου Κ α4β2 υποδοχέα με SDS PAGE και στύπωμα western έδειξε ότι ο υποδοχέας είχε απομονωθεί και καθαριστεί σε ικανοποιητικό βαθμό. Η έκφραση των ΑΤ και Κ υποδοχέων στο στέλεχος GS 115 του ζυμομύκητα P. pastoris δεν ήταν το ίδιο επιτυχημένη με την αντίστοιχη έκφραση σε κύτταρα εντόμων. Οι υπομονάδες των υποδοχέων δεν ανιχνεύτηκαν στην ανάλυση με στύπωμα western, ενώ η ανάλυση με δέσμευση 3Η-επιβατιδίνης έδειξε ότι εκφράστηκαν σε επίπεδα πολύ χαμηλότερα σε σχέση με αυτά των κυττάρων εντόμων. Τέλος τα ποσοστά διαλυτοποίησης που επιτυγχάνονταν με τον ζυμομύκητα P. pastoris ήταν επίσης πολύ χαμηλότερα από τα αντίστοιχα των κυττάρων εντόμων, οπότε η μελέτη δεν προχώρησε περεταίρω με αυτό το σύστημα έκφρασης. Συμπερασματικά μέσα από την παρούσα μελέτη, προέκυψε ένας ανθρώπινος νευρικός α4β2 nAChR χωρίς κυτταροπλασματική θηλιά, εκφρασμένος σε κύτταρα εντόμων με τη βοήθεια βακιλοϊού, ο οποίος εκφράζεται και διαλυτοποιείται πολύ περισσότερο από τον φυσικό υποδοχέα και επιπλέον μπορεί να απομονωθεί και να καθαριστεί σχετικά εύκολα. Η απουσία της εύκαμπτης κυτταροπλασματικής θηλιάς αναμένεται να διευκολύνει τον σχηματισμό κρυστάλλων του υποδοχέα στα πειράματα κρυστάλλωσης, τα οποία έχουν ήδη ξεκινήσει, καθώς και την ανάλυση των δεδομένων εφόσον προκύψουν πρωτεϊνικοί κρύσταλλοι. Τέλος οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση ΑΤ και Κ α4β2 nAChR μεταξύ κυττάρων εντόμων και ζυμομύκητα P. pastoris, ελέγχθηκαν εκφράζοντας στα συστήματα αυτά μια μικρότερη, συγγενική πρωτεΐνη, η οποία αποτελείτο μόνο από το ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού τύπου nAChR. Το εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων α1-ECD (i-α1-ECD) βρέθηκε να έχει μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενών σε σχέση με το εκφρασμένο σε ζυμομύκητα P. pastoris (y-α1-ECD), καθώς επίσης μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης αντι-nAChR mAb, αποτελέσματα τα οποία μαζί με αντίστοιχα του κυκλικού διχρωϊσμού έδειξαν βελτιωμένη δομή, επιβεβαιώνοντας ότι τα κύτταρα εντόμων εκφράζουν καλύτερα nAChR σε σχέση με το ζυμομύκητα P. pastoris. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι το i-α1-ECD είναι καταλληλότερο τόσο για δομικές μελέτες όσο και για βελτιωμένες θεραπείες της βαριάς μυασθένειας. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are models for the superfamily of pentameric ligand gated ion channels. They are involved both in many physiological functions and in many diseases, attracting major scientific interest. nAChRs are distinguished in muscle and neuronal type. Neuronal α4β2 nAChRs have been expressed and studied using ligand binding and electrophysiology technics. Nevertheless high resolution structural studies like X-ray crystallography have not yet been referred, and one main reason for that may be the flexible conformation of the cytoplasmic loop between the transmembrane helixes M3 and M4, which is very likely to prevent the membrane protein crystallization process. In the present study the wild type (WT) human α4β2 nAChR and a truncated construct (T), that lacked the cytoplasmic loop, were expressed both in Sf9 insect cells using baculovirus and in the yeast Pichia pastoris. The aim of the present study was the expression and purification of a human α4β2 nAChR type receptor, suitable for use in high resolution structure analysis, and especially in X-ray crystallography. Recombinant baculoviruses were constructed, containing the α4β2 nAChR subunits cDNAs. They were used to infect Sf9 insect cells, made them to coexpress the WT or T α4 and β2 subunits. WT and T receptor subunits were detected expressed in the expected molecular weights, while 125Ι-epibatidine binding proved that α4 and β2 subunits had formed ligand binding sites. The best expression time was found to be 72 hours post infection and the best α4/β2 recombinant baculovirus ratios were found to be between 1:1 and 1:3. Nicotine addition to the medium did not make any difference in the expression levels. 3Η-epibatidine binding studies showed 2 times stronger affinity for the WT than the T receptor and 7 times higher expression levels for the T than the WT receptor. Non labeled ligand binding studies showed also 2 times stronger affinity for the WT than the T nAChR. Other experiments indicated that 25 oC and the Triton X-100 detergent were the best combination for the receptor’s solubilization. Other solubilization experiments showed T nAChR solubilized 4 times better than the WT. Purification experiments continued only for T construct due to its higher expression levels and better solubilization efficiency. T α4β2 receptor was originally purified using ion metal affinity chromatography and subsequently gel filtration chromatography, which showed that T receptor has elution volume compatible with the expected MW. This result together with the receptors’ ligand binding capabilities certified that the coexpressed α4 and β2 subunits formed oligomeric receptors. SDS PAGE and western blot analysis indicated that T nAChR was satisfactory purified. The expression of the WT and T receptors in the strain GS 115 of the yeast P. pastoris was not as successful as the expression in insect cells. Receptor subunits were not detected using western blot analysis, whereas 3Η-epibatidine binding studies indicated expression levels much lower than that of insect cells. Finally, solubilization of the yeast expressed WT and T α4β2 nAChRs was very poor compared with that of insect cells. Due to all the above results, the yeast expression of the WT and T nAChRswas discontinued. In conclusion, by the present study, a new human α4β2 nAChR without cytoplasmic loop was emerged, expressed in sf9 insect cells using baculovirus, with much higher expression levels and solubilization yields than that of the natural receptor and capable for easy purification. The absence of the unordered cytoplasmic loop is expected to facilitate the crystal formation and the analysis of any protein crystals might derive from the crystallization efforts which have been already started. Finally, the differences of the expressed WT and T α4β2 nAChRs between insect cells and the yeast P. pastoris were further confirmed by expressing a small, related protein, the ECD of the α1 subunit of human muscle nAChR in both systems and comparing the two expressed α1 ECDs. The insect expressed α1 ECD (i-α1-ECD) was found to have higher immunoadsorption capacity for anti-nAChR autoantibodies from myasthenia patients sera than the yeast expressed (y-α1-ECD) and also higher binding ability for anti-nAChR mAbs. These results together with circular dichroism results showed a more native-like structure for the i-α1-ECD, confirming that insect cells express better nAChRs comparing to the yeast P. pastoris. Furthermore it was proved that i-α1-ECD was a better candidate for structural studies and more suitable for selective myasthenia gravis therapies.

Σκοπός της μελέτης ήταν η αποσαφήνιση των μηχανισμών με τους οποίους η P.aeruginosa διαντιδρά με τους PRRs των μακροφάγων. Από τα δεδομένα μας οι υποδοχείς TLR2 και Mannose receptor συνεργάζονται προς μέγιστη ενεργοποίηση των μακροφάγων σε απάντηση στη λοίμωξη από P.aeruginosa / The aim of the study was to delineate the mechanisms of P.aeruginosa interaction with specific PRRs on macrophages. Our data suggest that TLR2 and Mannose receptor synergize for maximum activation of human macrophages during Pseudomonas infection.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB). Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς. Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς. Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας. Οι νευρικοί nAChRs βρίσκονται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, όπου διαβιβάζουν τις νευρικές ώσεις. Σχηματίζουν είτε ετεροπενταμερή, μεταξύ 2-3 α-υπομονάδων (υπότυποι α2-6) και 2-3 β-υπομονάδων (υπότυποι β2-4), ή ομοπενταμερή. Η α7 είναι η μόνη γνωστή υπομονάδα του νευρικού nAChR που σχηματίζει ομοπενταμερή μόρια στον άνθρωπο, με πέντε θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Μέχρι στιγμής, έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερα σημαντικά επιτεύγματα, όσον αφορά την κατανόηση της δομής των nAChRs: Α. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, της ομόλογης προς τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nAChR (25% αμινοξική ταύτιση με την α7), ομοπενταμερούς πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh γαστεροπόδων (AChBP), καθώς και των δομών της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες. Προσεγγίστηκε έτσι για πρώτη φορά η διαμόρφωση των nAChR-θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Β. Η λύση της δομής, με ηλεκτρονική μικροσκοπία, του Torpedo nAChR, η οποία αποκάλυψε την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του nAChR. Εντούτοις, λόγω της περιορισμένης ευκρίνειας (4 Å), δεν αποκάλυψε τη συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης της ACh σε ατομικό επίπεδο. Γ. Η λύση της δομής σε υψηλή ευκρίνεια (1,94 Å) του συμπλόκου της α1-ΕΚΠ επίμυος με τον nAChR- ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx). Η λυση αυτής της δομής αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο την MIR περιοχή, τις θηλιές Α, B και C της κυρίως πλευράς των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών και τη χαρακτηριστική Cys θηλιά. Δεδομένου όμως, ότι η δομή της α1-ΕΚΠ αναπαριστά ένα μονομερές, η δομή μίας πλήρως διαμορφωμένης θέσης πρόσδεσης εξακολουθεί να απουσιάζει. Δ. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC), η οποία θεωρείται μάλιστα πως αποτελεί τον πρόγονο όλων των ευκαρυωτικών LGICs, συμπεριλαμαβανομένου του nAChR, με την οποία αποκαλύφθηκε ο βασικός σκελετός της δομής των LGICs. Είναι φανερό, ότι παρόλα αυτά τα επιτεύγματα, απουσιάζει ακόμη η λύση της δομής ενός πενταμερούς nAChR. Η νευρική α7 υπομονάδα του nAChR είναι μία καλή υποψήφια για την επίτευξη αυτού του στόχου, αφού σχηματίζει πενταμερή in vivo. Επιπλέον, αυτή εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό νευρικών παθήσεων (Alzheimer, Parkinson, επιληψία, σχιζοφρένεια, κλπ), και η λύση της δομής της θα οδηγήσει και στο σχεδιασμό θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτών των ασθενειών. Μάλιστα, εφ’όσον στην α7- ΕΚΠ εδράζουν οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, είναι πιο ρεαλιστική η προσπάθεια κρυστάλλωσης αυτής της περιοχής αντί ολόκληρου του α7 nAChR, αφού οι εκτενείς υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές του τελευταίου περιορίζουν τη διαλυτότητά του. Στο παρελθόν είχαμε εκφράσει στο Εργαστήριό μας την ανθρώπινη α7-EKΠ αγρίου τύπου και ένα διπλό μετάλλαγμα αυτής, σε κύτταρα P. pastoris, με στόχο μελέτη της δομής τους. Τα μόρια αγρίου τύπου, βρέθηκαν όμως να είναι αρκετά υδρόφοβα, αφού εκφράσθηκαν ως συσσωματώματα πολύ υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) και ως ολιγομερή μεγαλύτερα από πενταμερή. Τα μόρια του διπλού μεταλλάγματος, στα οποία ολόκληρη η Cys θηλιά του α7 nAChR αντικαταστάθηκε από την πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της AChBP σε συνδυασμό με την μετάλλαξη Cys116Ser, εμφάνισαν μεν αυξημένη διαλυτότητα και ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, διατήρησαν όμως δε ένα σημαντικό βαθμό δημιουργίας συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ, οδηγώντας σε αποτυχείς προσπάθειες κρυστάλλωσής τους. Στην παρούσα μελέτη, στηριχθήκαμε στο τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7- ΕΚΠ, το οποίο κατασκευάσαμε χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία τις, μόνες γνωστές έως τότε, δομές της AChBP και της α-EKΠ του Torpedo nAChR, προκειμένου να σχεδιάσουμε νέες μεταλλάξεις για την ενίσχυση της διαλυτότητας και της πενταμερούς συγκρότησης των α7- ΕΚΠ μορίων. Έτσι, μεταλλάξαμε τα εκτεινόμενα, στο εξωτερικό περιβάλλον του μοντέλου, υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα προς λιγότερο υδρόφοβα, με στόχο την αύξηση της διαλυτότητας των εκφραζόμενων α7-ΕΚΠ μορίων, καθώς και μερικά κατάλοιπα της διεπιφάνειας μεταξύ γειτονικών α7-ΕΚΠ πρωτομερών προς μεγαλύτερα ή φορτισμένα, με στόχο την εισαγωγή επιπλέον υδρογονικών ή ηλεκτροστατικών δεσμών με αντικρυστά κατάλοιπα της γειτονικής α7-ΕΚΠ υπομονάδας. Η μελέτη των χρωματογραφημάτων μοριακής διήθησης και δυναμικής σκέδασης του φωτός όλων των προκύπτοντων α7-ΕΚΠ μεταλλαγμάτων υπέδειξε ότι αυτά που έφεραν μεταλλάξεις σε κατάλοιπα της διεπιφάνειας εκφράσθηκαν όπως τα μόρια αγρίου-τύπου, ενώ αυτά που έφεραν την αντικατάσταση των εκτειθέμενων υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων από λιγότερο υδρόφοβα, εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου. Μάλιστα, ένα τουλάχιστον τέτοιο μετάλλαγμα (mut-10), εμφάνισε σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα και ως προς το προϋπάρχον διπλό μετάλλαγμα, αφού εκφράσθηκε αποκλειστικά υπό τη μορφή ολιγομερών με κοντινό στο θεωρητικά αναμενόμενο ΜΒ για πενταμερή μόρια. Επιπλέον, εμφάνισε μία σημαντικά αυξημένη συγγένεια πρόσδεσης για τον σημασμένο ανταγωνιστή 125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου (Kd = 70 nM) και διπλού μεταλλάγματος (Kd = 52 nM), η οποία πρόσδεση βρέθηκε να αναστέλλεται από μη σημασμένα μόρια α-bgtx, d-τουμποκουραρίνης ή νικοτίνης (Ki = 21,5 nM, Ki = 127 μM, Ki = 17,5 mM, αντίστοιχα). Οι τιμές αυτές των σταθερών για το mut-10 είναι χαμηλότερες από αυτές των μορίων αγρίου τύπου και άλλων μεταλλαγμάτων, ενώ είναι αρκετά κοντινές προς αυτές του φυσικού μορίου α7 nAChR, υποδηλώνοντας ταυτόχρονα την αύξηση στην ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, αλλά και την κοντινή διαμόρφωση του mut-10 στο χώρο με αυτό των φυσικών μορίων. Επιπρόσθετα, μελέτες κυκλικού διχρωϊσμού, αποκάλυψαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα mut-10 μόρια, καθώς και τοπικές αλλαγές στη διαμόρφωσή τους κατά την πρόσδεση διάφορων χολινεργικών προσδετών. Επίσης, αποκάλυψαν τη σύσταση της δευτεροταγούς δομής των ανθρώπινων α7-ΕΚΠ μορίων, η οποία βρέθηκε να είναι ~45% β-πτυχωτή επιφάνεια και 5% α-έλικα, σε συμφωνία με αυτή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR, της AChBP και της α1-EKΠ του nAChR επίμυος. Τέλος, με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκαλύφθηκε ένας υψηλός βαθμός ομοιογένειας των εκφραζόμενων mut-10 μορίων, και η συγκρότησή τους πιθανότατα σε πενταμερή με εμφανή το χαρακτηριστικό κεντρικό πόρο, ο οποίος αποτελεί την απαρχή του ιοντικού καναλιού σε ολόκληρο τον α7 nAChR. Συμπερασματικά, το μετάλλαγμα mut-10 της παρούσης μελέτης είναι κατάλληλο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, απαραίτητες για την έναρξη ενός ορθολογικού σχεδιασμού φαρμάκων έναντι των ασθενειών που συνδέονται με τον α7 nAChR. Επιπλέον, δεδομένου ότι τα απογλυκοζυλιωμένα mut-10 μόρια διατήρησαν την υδροφιλικότητα, την ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών και τη δευτεροταγή τους δομή, αυτά είναι επίσης κατάλληλα για κρυσταλλώσεις, αφού μάλιστα σε αυτή την περίπτωση αυξάνεται πιθανότατα και ο βαθμός ομοιογένειάς τους. Ένας παράλληλος σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η ανίχνευση με μελέτες κυκλικού διχρωϊσμού, της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των α1-, β1-, γ- και ε- ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR, τα οποία είχαν επίσης εκφρασθεί σε κύτταρα P. pastoris. Οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν ότι το κυρίαρχο δευτεροταγές δομικό χαρακτηριστικό όλων αυτών των μορίων ήταν η β-πτυχωτή επιφάνεια (~40%), ενώ παρατηρήθηκε και μία μικρή συμμετοχή α-έλικας (~5%), σε συμφωνία με την δευτεροταγή δομή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR και της AChBP και με τη μεταγενέστερη των αποτελεσμάτων αυτών, λύση της δομής της α1-ΕΚΠ του nAChR επίμυος. Επίσης, επιβεβαίωσαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα μόρια αυτά, κάτι που είχε στο παρελθόν υπαινιγχθεί από βιοχημικές και ανοσοχημικές μελέτες. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν την κοντινή προς τα φυσικά μόρια διαμόρφωση των ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR που εκφράζονται στο Εργαστήριό μας, και ενισχύουν τη χρήση τους για περαιτέρω δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, αλλά και ως ειδικούς ανοσοπροσροφητές των αντι-nAChR αντισωμάτων ορών μυασθενικών σε μία, υπό ανάπτυξη από το Εργαστήριό μας, αντιγονο-ειδική θεραπευτική προσέγγιση της βαριάς μυασθένειας. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGICs), also including serotonin (5-HT3), glycine and γ- aminobutyric acid receptors (GABAA and GABAC). Each nAChR subunit consists of an Nterminal extracellular domain (ECD), harbouring the signature Cys-loop, four transmembrane α-helices and a small cytoplasmic loop. nAChRs are classified into muscle and neuronal types. Muscle-type nAChRs are found in fish electric organs and at the vertebrate neuromuscular junctions, where they mediate neuromuscular transmission. They form heteropentamers with a stoichiometry (α1)2β1γδ or (α1)2β1εδ in adult mammalian nAChR and bear two ligand-binding sites formed between α1- and γ(ε)- or δ-ECDs. The α1-ECD hosts the main immunogenic region (MIR), against which a large number of anti-nAChR antibodies are directed in the autoimmune disease, myasthenia gravis. Neuronal nAChRs are widely distributed in the central and peripheral nervous system and play key roles in neuron-neuron interactions. They exist either as heteropentamers of 2-3 α subunits (subtypes α2–6) plus 2-3 β subunits (β2–4) or as homopentamers. α7 is the only human neuronal subunit known to form a homopentamer with five ligand-binding sites between its ECDs. Regarding the atomic structure of nAChR, four major breakthroughs have been achieved so far: A. The X-ray crystal structure of the homologous to nAChR α-ECDs (25% sequence identity with α7), molluscan homopentameric acetylcholine-binding protein (AChBP) and its complexes with various cholinergic ligands, which approached the structure of the nAChR ligand-binding site in atomic detail for the first time. Β. Τhe 4Å electron microscopy (EM) structure of the Torpedo nAChR, which revealed the architecture of the muscle-type nAChR-ECDs and the fivefold symmetry of the receptor. Nevertheless, given the relatively low-resolution, no atomic details for the ligand-binding site could be observed. C. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex of mouse muscle α1-ECD with the nAChR antagonist α-bungarotoxin (α-bgtx), which revealed atomic details for the MIR epitope, the loops A, B and C, forming the principal side of the nAChR ligandbinding pocket and the Cys-loop. However, since the structure of mouse α1-ECD is a monomer, the nAChR ligand-binding site is still missing. D. The high-resolution X-ray crystal structure of a prokaryotic LGIC (ELIC protein) considered to be the ancestor of eukaryotic LGICS, including the nAChR, which revealed the core structure of the LGICs. Apparently, it still remains essential to obtain the structure of a pentameric nAChR-ECD in high-resolution, so as to look deep into the details of the complete nAChR ligand-binding pockets. Neuronal α7 nAChR is a good candidate for achieving this goal, as it forms homopentamers. Furthermore, since α7 nAChR is implicated in neurological diseases and disorders (Alzheimer’s, Parkinson’s, epilepsy, schizophrenia, etc), elucidation of its structure will also lead to the rational drug-design towards these diseases. Furthermore, since the α7-ECD is of the main pharmacological interest as this bears the ligand-binding sites, it seems more realistic to perform crystallization trials on this domain, rather than on the intact α7 nAChR, due to the large hydrophobic transmembrane domains of the latter. Our laboratory has previously expressed the wild-type and a double mutant of human α7-ECD in yeast P. pastoris, with the aim to proceed to their detailed structural analysis. However, the wild-type was expressed in the form of microaggregates and oligomers larger than the expected pentamers, whereas the double mutant, carrying the mutation Cys116Ser and the replacement of its Cys-loop by the more hydrophilic AChBP Cys-loop, appeared to be more soluble than the wild-type and capable of binding α-bgtx with an increased affinity, relatively close to that of the native α7 nAChR. However, this mutant was still aggregationprone to some extent, thus leading to unsuccessful crystallization trials. Therefore, in the present study, we based on the model of human α7-ECD constructed using as templates the X-ray crystal structure of L-AChBP and the electron microscopy structure of the Torpedo nAChR α1-ECD, and introduced several mutations in α7-ECD so as to enhance both its solubility and assembly to pentamers. The hydrophobic amino acid residues found exposed to the environment of α7-ECD model were mutated to less hydrophobic ones, with the aim to reduce the considerably high hydrophobicity of α7-ECD molecules, while various residues facing the interface between two adjacent α7-ECD protomers were mutated to larger or charged residues, with the aim to introduce additional hydrogen or electrostatic bonds with facing residues of the adjacent protomer. Gel filtration and dynamic light scattering analysis for the novel α7-ECD mutants under study, suggested that the mutants carrying mutations in the interface-located amino acid residues were expressed similarly to the wild-type, whereas the mutants carrying the substitution of external hydrophobic residues by less hydrophobic ones, all appeared significantly more water-soluble than the wild-type molecules. Moreover, at least one mutant (mut-10) presented enhanced solubility compared to both the wild type and the previously studied soluble double mutant, as it was expressed exclusively to oligomers close to a pentameric form. Furthermore, it displayed a significantly improved binding affinity for the nAChR antagonist 125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), compared to the wild type (Kd = 70 nM) and to the double mutant (Kd = 52 nM), the binding being inhibited by unlabelled α-bungarotoxin, d-tubocurarine or nicotine (Ki = 21.5 nM, Ki = 127 μM, Ki = 17.5 mM, respectively). These values for mut-10 are comparable to those for the native α7 nAChR, denoting its native-like conformation. Circular dichroism (CD) studies on mut-10 suggested a well-defined tertiary structure and special local conformational changes upon binding of several cholinergic ligands. They also revealed a secondary structure composition (~5% α- helix, ~45% β-sheet) similar to that of the homologous Torpedo nAChR-ΕCDs, AChBP and mouse muscle α1-nAChR-ECD. Finally, electron microscopy studies revealed a high degree of homogeneity and well-assembled particles of the expressed mut-10, probably pentameric, with the characteristic formation of the central hole, which in the case of the intact α7 nAChR continues to the central pore. In conclusion, the mutagenesis strategy followed in the current study, towards a crystallisable α7-ECD form, led to the construction and expression of at least one novel mutant (mut-10), which is a promising starting material for atomic-resolution studies, essential for rational drug design towards diseases related to the α7-nAChR. Furthermore, since its deglycosylated form maintained its solubility, ligand-binding properties and secondary structure, it is even more appropriate for crystallization, as it appears to be more homogeneous than the glycosylated molecules. Another aim of the present study was to probe the structure of the α1-, β1-, γ- and ε- ECDs of the human muscle nAChR, previously expressed in yeast P. pastoris, by performing CD studies. These studies demonstrated that the dominant structural feature of all these ECDs is β-sheet structure (~40%) with a small contribution of α-helical content (~5%). This was the first time direct experimental evidence appeared for the secondary structure composition of human nAChR-ECDs, which seems to be in very good agreement with that of the similar Torpedo muscle-type nAChR-ECDs and in considerable, though lower, agreement with that of the less homologous AChBPs. The subsequent structure solution of the α1-ECD of the mouse muscle nAChR in high resolution, further confirmed the native-like conformation of the human muscle nAChR-ECDs expressed in our laboratory, since their secondary structure composition was also in considerable agreement with that of mouse α1-ECD (47% β-sheet; 7% α-helix). The CD studies also suggested well-defined tertiary structures and considerable folding for all human muscle nAChR-ECDs under study, as this was previously implied by biochemical and immunochemical studies. In conclusion, these results strongly suggest that the ECDs of the human muscle nAChR under study fold to a near-native conformation, confirming their suitability for more detailed structural studies and for their use as specific immunoadsorbents in an under development antigen-specific therapeutic strategy to remove pathogenic anti-nAChR antibodies from myasthenic patients’ sera.

Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ενεργοποιούμενες με τη δέσμευση της ακετυλοχολίνης (ACh). Με κριτήρια, όπως η χημική συγγένεια που εμφανίζουν για σηματοδότικά μόρια και οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες, ταξινομούνται στην ομάδα των νικοτινικών AChRs και στην ομάδα των μουσκαρινικών AChRs. Οι νικοτινικού τύπου υποδοχείς δημιουργούνται από τη συναρμογή πέντε ομόλογων υπομονάδων και υποδιαιρούνται σε μυϊκού τύπου, ευρισκόμενους κυρίως στους σκελετικούς μύες των σπονδυλωτών και σε νευρικού τύπου, απαντώμενους κατά κύριο λόγο στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα. Οι AChRs σχετίζονται με σειρά παθολογικών καταστάσεων, μεταξύ των οποίων και η βαρειά μυασθένεια (Myasthenia Gravis-MG). Η μυασθένεια χαρακτηρίζεται από χρόνια μυϊκή αδυναμία, προκαλούμενη από τη δράση αντισωμάτων υψηλής συγγένειας έναντι του μυϊκού τύπου AChR. Με απώτερο σκοπό τη διερεύνηση της παθογονικότητας των αυτοαντισωμάτων έναντι μεμονωμένων υπομονάδων του AChR, προχωρήσαμε στην παραγωγή ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδικών τμημάτων των υπομονάδων στο ζυμομύκητα Pichia pastoris. Τα πολυπεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν στην παρασκευή χρωματογραφικών-ανοσοπροσροφητικών στηλών, που εφαρμόστηκαν ακολούθως για την απομόνωση αυτοαντισωμάτων από επιλεγμένους ορούς μυασθενικών ατόμων. Η παθογόνος δράση των απομονωμένων αυτοαντισωμάτων ελέχθηκε μέσω της προκαλούμενης απώλειας υποδοχέων (αντιγονική τροποποίηση-antigenic modulation) σε κυτταρική σειρά (ΤΕ671) που εκφράζει τον AChR και μέσω της χορήγησή τους σε πειραματόζωα και τον έλεγχο της εμφάνισης χαρακτηριστικών συμπτωμάτων της νόσου. Εκτενής συγκριτική μελέτη μεταξύ τεσσάρων επιλεγμένων ορών και αντισωμάτων έναντι της α1 και της β υπομονάδας του υποδοχέα, που απομονώθηκαν από τους συγκεκριμένους ορούς, έδειξαν πως τα αυτοαντισώματα ευθύνονται για δράση των ορών στους υποδοχείς των κυττάρων. Τόσο οι ολικοί οροί όσο και τα απομονωμένα-καθαρά αυτοαντισώματα έναντι των υπομονάδων α1 και β, προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενη απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα και μάλιστα τα αντι-α1 αντισώματα εμφανίστηκαν περίπου τέσσερις φορές δραστικότερα από τα αντι-β. Η ικανότητα των μερικώς απαλλαγμένων από αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα ορών να προκαλούν απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα, φάνηκε να ποικίλλει και να συσχετίζεται άμεσα με το είδος των αντισωμάτων που έχουν παραμείνει στον ορό, υποστηρίζοντας μια διαφορετικότητα στην παθογονικότητα των επιμέρους αντισωμικών κλασμάτων. Με σκοπό την επιβεβαίωση και ενίσχυση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τα in vitro πειράματα, ακολούθησαν προσπάθειες για την πρόκληση πειραματικής μυασθένειας σε πειραματόζωα, με τη χορήγηση ορών μυασθενικών και καθαρών αυτοαντισωμάτων έναντι διαφόρων υπομονάδων του υποδοχέα. Η χορήγηση σε ζώα τόσο του ολικού ορού, όσο και καθαρών αντισωμάτων έναντι της α1-υπομονάδας του υποδοχέα, προκάλεσαν σημαντική απώλεια βάρους και εμφάνιση έντονων συμπτωμάτων μυϊκής αδυναμίας, μέχρι και το θάνατο. Πειραματόζωα που ενέθηκαν με το κλάσμα του ορού από το οποίο έχουν απομακρυνθεί τα συγκεκριμένα αντισώματα εμφάνισαν πολύ ηπιότερα ή και καθόλου συμπτώματα, ενώ απουσία συμπτωμάτων καταγράφηκε και κατά τη χορήγηση ορού που περιείχε αποκλειστικά αντισώματα έναντι της β υπομονάδας, αλλά και απομονωμένων αντι-β αντισωμάτων. Η παρούσα μελέτη υπέδειξε τα αυτοαντισώματα έναντι του AChR ως τον μοναδικό παθογόνο παράγοντα στον ορό μυασθενικών ατόμων, συμβάλλοντας στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Επιβεβαίωσε την υπεροχή των αντι-α1 αντισωμάτων έναντι των αντι-β, ως πρός την παθογονικότητά τους, τόσο in vitro όσο και in vivo, με την επιφύλαξη βέβαια που επιβάλλει ο μικρός αριθμός δειγμάτων που μελετήθηκαν. Η δυνατότητα λήψης αντισωμάτων που στοχεύουν σε συγκεκριμένη υπομονάδα μπορεί να συμβάλλει στη λεπτομερή μελέτη της δραστικότητας του κλάσματος και να οδηγήσει στη συσχέτισή του με την εμφάνιση συγκεκριμένων συμπτωμάτων της νόσου. / Acetylcholine receptors (AChRs) are integral membrane proteins that respond to the binding of acetylcholine (ACh), which is synthesized, stored and finally released by cholinergic neurons. Like other transmembrane receptors, AChRs have been classified according to either their pharmacological properties or their relative affinities for various molecules, and can therefore be further divided into: i) nicotinic AChRs, which are particularly responsive to nicotine and ii) muscarinic AChRs, which are particularly responsive to muscarine. AChRs are involved in myasthenia gravis (MG) and many other physiological disorders, mainly affecting the central and peripheral nervous system. In MG, autoantibodies are directed against the nicotinic AChR at the neuromuscular junction. The disease is characterized by various symptoms, including muscle weakness and fatigability, due to defective neuromuscular transmission. To obtain an insight into the role of the various anti-AChR antibody specificities in MG, we isolated and studied the in vitro and in vivo activity of autoantibodies targeting individual AChR subunits. Using recombinant proteins corresponding to extracellular domains (ECDs) of individual AChR subunits as immunoadsorbents; we isolated autoantibodies which specifically bind to these subunits. We then used the well established TE671 human muscle cell line to examine the in vitro functions of subunit-specific autoantibody populations through their ability to induce nAChR antigenic modulation. Isolated subunit-specific autoantibodies were also used to determine their capacity to passively transfer experimental MG into lab animals. Our results clearly demonstrated that autoantibodies against the α1 or β subunit can cause AChR loss via antigenic modulation in a dose-dependent manner, the anti-α1 autoantibodies being much more effective than the anti-β autoantibodies. Furthermore, we showed that the autoantibody-depleted sera were much less effective, or were completely inactive, at causing AChR loss. In in vivo experiments, the administration of MG sera derivatives to lab animals showed that sera enriched in anti-α1 autoantibodies, as well as the corresponding pure anti-α1 autoantibodies from two individuals, are efficient in inducing MG like symptoms to the animals. A single serum contained almost 100% anti-β antibodies and the corresponding purified antibodies did not cause any clinical MG symptoms. The depleted fraction of MG sera tested, induced mild symptoms or no symptoms were observed, and this is in agreement with the in vitro results, strongly suggesting that the anti-AChR autoantibodies in MG sera and mainly the anti-α1 specificities are the sole pathogenic factor in anti-AChR antibody-seropositive MG.