Η καλλικρεΐνη 6 (του ανθρώπου συμβολίζεται ως ΚLK6, ενώ του ποντικού ως Klk6), φαίνεται πως σχετίζεται με νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και η νόσος του Parkinson, καθώς επίσης και με διάφορους τύπους καρκίνου. Επομένως, η μελέτη του ρόλου που διαδραματίζει η ΚLK6 στις παραπάνω ασθένειες σε πειραματικά πρότυπα ποντικού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατανόηση αυτών των ασθενειών και στον άνθρωπο. Στην παρούσα εργασία αρχικά παρήχθη η ώριμη Κlk6 ποντικού ως ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο σύστημα έκφρασης του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα Pichia pastoris KM71 και δείχθηκε ότι η παραχθείσα πρωτεΐνη ήταν ενζυμικά δραστική. Το cDNA που κωδικοποιεί την ώριμη Klk6 πρωτεΐνη απομονώθηκε με RT-PCR από τον εγκέφαλο ποντικού C57BL6. Το προϊόν πολλαπλασιάστηκε με αντίδραση PCR και μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα XhoI και EcoRI κλωνοποιήθηκε στον φορέα pPIC9. Ο ζυμομύκητας Pichia pastoris KM71 μετασχηματίσθηκε με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pPIC9/ώριμη Klk6 με τη μέθοδο των σφαιροπλαστών. Από τους ανασυνδυασμένους κλώνους του ζυμομύκητα που μετασχηματίσθηκαν με το πλασμίδιο έκφρασης απομονώθηκε πλασμιδικό DNA και η ορθή κλωνοποίηση και η απουσία μεταλλάξεων στην προς έκφραση αλληλουχία DNA επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχηση. Στη συνέχεια, οι ανασυνδυασμένοι κλώνοι αναπτύχθηκαν σε υγρή καλλιέργεια και ελέχθηκε στο υπερκείμενο η παραγωγή ανασυνδυασμένης Klk6, δεδομένου ότι το σύστημα έκφρασης έχει σχεδιασθεί ώστε η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη να εκκρίνεται. Η ανασυνδυασμένη Klk6 απομονώθηκε από το υπερκείμενο και καθαρίσθηκε με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανοικτής στήλης. Μετά τον καθαρισμό, η απόδοση της παραγωγής ήταν 4,16 mg ανασυνδυασμένης Klk6 πρωτεΐνης ανά λίτρο (lt) αρχικής καλλιέργειας Η ενζυμική δραστικότητα της ανασυνδυασμένης Klk6 πρωτεΐνης ελέγχθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης και καζεΐνης (ως υποστρώματα), καθώς και με βάση την ικανότητα υδρόλυσης χρωμογόνων συνθετικών πεπτιδικών υποστρωμάτων και πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος ειδικού για την Klk6 πρωτεΐνη του ποντικού. Για την ανοσοποποίηση χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια με αλληλουχία που αντιστοιχεί σε δύο μη επικαλυπτόμενες περιοχές της Klk6, οι οποίες -κατά την υπολογιστική πρόβλεψη- χαρακτηρίζονται από υψηλή υδροφιλικότητα και αντιγονικότητα. Για την ανοσοποίηση, τον έλεγχο του τίτλου και τον καθορισμό των αντισωμάτων ακολουθήθηκαν καθιερωμένα πρωτόκολλα. Μετά τον καθαρισμό το κλάσμα των IgG αντισωμάτων αξιολογήθηκε ως προς την εξειδίκευση και τη συγγένεια έναντι της Klk6 ποντικού, χρησιμοποιώντας αρχικά την ανασυνδυασμένη Klk6 πρωτεΐνη, που παρήχθη όπως περιγράφηκε. Βρέθηκε ότι το παραχθέν πολυκλωνικό αντίσωμα αναγνωρίζει την πρωτεΐνη με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία και το όριο ανίχνευσης προσδιορίσθηκε με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών στα 50 ng. Τέλος, με RT-PCR αναλύθηκε το προφίλ έκφρασης της Klk6 σε ιστούς του ποντικού χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο Klk6. Χρησιμοποιώντας ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τους ιστούς εκείνους του ποντικού που βρέθηκε ότι εκφράζουν την Klk6, δείξαμε ότι το παραχθέν αντι-Klk6 πολυκλωνικό αντίσωμα αναγνωρίζει την ενδογενή Klk6 πρωτεΐνη με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία παρήχθη με μεγάλη απόδοση ανασυνδυασμένη Klk6 πρωτεΐνη και με ενζυμικές δοκιμές δείχθηκε ότι είναι ενζυμικά δραστική, δηλαδή είχε την προβλεπόμενη πρωτεολυτική δράση. Επίσης, παρήχθη το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-Klk6 και δείχθηκε ότι αναγνωρίζει με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα τόσο την ανασυνδυασμένη όσο και την ενδογενή Klk6 πρωτεΐνη σε ιστούς ποντικού και ως εκ τούτου θα αποτελέσει πολύτιμο εργαλείο για να μελετηθεί σε πρότυπα ποντικού ο ρόλος της πρωτεάσης Klk6 και η συμμετοχή της σε σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με σοβαρές ασθένειες, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και η νόσος του Parkinson. / The kallikrein-related peptidase 6 (KLK6 for human; Klk6 for mouse) has been implicated in neurodegenerative diseases including multiple sclerosis and Parkinson’s disease and in various types of cancer. Therefore, the investigation of the role(s) of Klk6 in mouse models used for the study of the aforementioned human diseases becomes a necessity. First in this study, active recombinant mouse Klk6 protein was produced in Pichia pastoris KM71. The cDNA encoding for the mature mouse Klk6 protein was obtained by RT-PCR from RNA extracted from mouse C57BL6 brain. The PCR product was digested with XhoI and EcoRI, purified and subsequently cloned into the pPIC9 expression vector. The methylotrophic yeast strain Pichia Pastoris KM71 was transformed with the pPIC9/mature Klk6 construct, linearized with SalI, with the spheroplast method. Recombinant yeast clones transformed with the expression construct pPIC9/mature Klk6 were identified, confirmed by DNA sequencing and grown in liquid culture for recombinant protein production. Recombinant Klk6 was isolated from the yeast culture supernatant and was purified by hydrophobic interaction chromatography (HIC). The yield of recombinant protein production was 4.16 mg/lt culture after purification. Then, rKlk6 was characterized, in terms of proteolytic activity, by gelatin and casein zymography and by digestion of chromogenic synthetic peptide substrates and protein substrates. Νo antibody is currently available that is highly specific for mouse Klk6. Here, a novel rabbit anti-peptide polyclonal for mouse Klk6 was generated. Peptides corresponding to two non-overlapping Klk6 sequences of high hydrophilicity and predicted antigenicity were synthesized, conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH) and used for immunization. The specificity and affinity of the purified polyclonal was assessed against active recombinant mouse Klk6 protein produced in Pichia pastoris KM71 as described, and the detection limit was determined at 50 ng by Western blot. Finally, the expression of Klk6 in mouse tissues was analyzed by semi-quantitative RT-PCR using gene-specific primers. Using whole extracts of Klk6 expressing mouse tissues, we showed that the purified anti-Klk6 polyclonal (IgG fraction) recognizes the endogenous Klk6 protein with a high sensitivity and specificity. Conclusively, the produced αντι-Klk6 polyclonal should be a valuable tool in studies employing mouse models in order to decipher the putative role(s) of Klk6 in signaling pathways involved in major human diseases, such as the multiple sclerosis and Parkinson’s disease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/7798 |
| Date | 10 June 2014 |
| Creators | Ζήνγκου, Ελένη |
| Contributors | Σωτηροπούλου, Γεωργία, Zingkou, Eleni, Ζαρκάδης, Ιωάννης, Ζουμπουρλής, Βασίλειος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0029 seconds