Η καλλικρεΐνη 6 (του ανθρώπου συμβολίζεται ως ΚLK6, ενώ του ποντικού ως Klk6), φαίνεται πως σχετίζεται με νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και η νόσος του Parkinson, καθώς επίσης και με διάφορους τύπους καρκίνου. Επομένως, η μελέτη του ρόλου που διαδραματίζει η ΚLK6 στις παραπάνω ασθένειες σε πειραματικά πρότυπα ποντικού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατανόηση αυτών των ασθενειών και στον άνθρωπο. Στην παρούσα εργασία αρχικά παρήχθη η ώριμη Κlk6 ποντικού ως ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο σύστημα έκφρασης του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα Pichia pastoris KM71 και δείχθηκε ότι η παραχθείσα πρωτεΐνη ήταν ενζυμικά δραστική. Το cDNA που κωδικοποιεί την ώριμη Klk6 πρωτεΐνη απομονώθηκε με RT-PCR από τον εγκέφαλο ποντικού C57BL6. Το προϊόν πολλαπλασιάστηκε με αντίδραση PCR και μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα XhoI και EcoRI κλωνοποιήθηκε στον φορέα pPIC9. Ο ζυμομύκητας Pichia pastoris KM71 μετασχηματίσθηκε με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pPIC9/ώριμη Klk6 με τη μέθοδο των σφαιροπλαστών. Από τους ανασυνδυασμένους κλώνους του ζυμομύκητα που μετασχηματίσθηκαν με το πλασμίδιο έκφρασης απομονώθηκε πλασμιδικό DNA και η ορθή κλωνοποίηση και η απουσία μεταλλάξεων στην προς έκφραση αλληλουχία DNA επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχηση. Στη συνέχεια, οι ανασυνδυασμένοι κλώνοι αναπτύχθηκαν σε υγρή καλλιέργεια και ελέχθηκε στο υπερκείμενο η παραγωγή ανασυνδυασμένης Klk6, δεδομένου ότι το σύστημα έκφρασης έχει σχεδιασθεί ώστε η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη να εκκρίνεται. Η ανασυνδυασμένη Klk6 απομονώθηκε από το υπερκείμενο και καθαρίσθηκε με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανοικτής στήλης. Μετά τον καθαρισμό, η απόδοση της παραγωγής ήταν 4,16 mg ανασυνδυασμένης Klk6 πρωτεΐνης ανά λίτρο (lt) αρχικής καλλιέργειας Η ενζυμική δραστικότητα της ανασυνδυασμένης Klk6 πρωτεΐνης ελέγχθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης και καζεΐνης (ως υποστρώματα), καθώς και με βάση την ικανότητα υδρόλυσης χρωμογόνων συνθετικών πεπτιδικών υποστρωμάτων και πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος ειδικού για την Klk6 πρωτεΐνη του ποντικού. Για την ανοσοποποίηση χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια με αλληλουχία που αντιστοιχεί σε δύο μη επικαλυπτόμενες περιοχές της Klk6, οι οποίες -κατά την υπολογιστική πρόβλεψη- χαρακτηρίζονται από υψηλή υδροφιλικότητα και αντιγονικότητα. Για την ανοσοποίηση, τον έλεγχο του τίτλου και τον καθορισμό των αντισωμάτων ακολουθήθηκαν καθιερωμένα πρωτόκολλα. Μετά τον καθαρισμό το κλάσμα των IgG αντισωμάτων αξιολογήθηκε ως προς την εξειδίκευση και τη συγγένεια έναντι της Klk6 ποντικού, χρησιμοποιώντας αρχικά την ανασυνδυασμένη Klk6 πρωτεΐνη, που παρήχθη όπως περιγράφηκε. Βρέθηκε ότι το παραχθέν πολυκλωνικό αντίσωμα αναγνωρίζει την πρωτεΐνη με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία και το όριο ανίχνευσης προσδιορίσθηκε με ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών στα 50 ng. Τέλος, με RT-PCR αναλύθηκε το προφίλ έκφρασης της Klk6 σε ιστούς του ποντικού χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο Klk6. Χρησιμοποιώντας ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τους ιστούς εκείνους του ποντικού που βρέθηκε ότι εκφράζουν την Klk6, δείξαμε ότι το παραχθέν αντι-Klk6 πολυκλωνικό αντίσωμα αναγνωρίζει την ενδογενή Klk6 πρωτεΐνη με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία παρήχθη με μεγάλη απόδοση ανασυνδυασμένη Klk6 πρωτεΐνη και με ενζυμικές δοκιμές δείχθηκε ότι είναι ενζυμικά δραστική, δηλαδή είχε την προβλεπόμενη πρωτεολυτική δράση. Επίσης, παρήχθη το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-Klk6 και δείχθηκε ότι αναγνωρίζει με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα τόσο την ανασυνδυασμένη όσο και την ενδογενή Klk6 πρωτεΐνη σε ιστούς ποντικού και ως εκ τούτου θα αποτελέσει πολύτιμο εργαλείο για να μελετηθεί σε πρότυπα ποντικού ο ρόλος της πρωτεάσης Klk6 και η συμμετοχή της σε σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με σοβαρές ασθένειες, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και η νόσος του Parkinson. / The kallikrein-related peptidase 6 (KLK6 for human; Klk6 for mouse) has been implicated in neurodegenerative diseases including multiple sclerosis and Parkinson’s disease and in various types of cancer. Therefore, the investigation of the role(s) of Klk6 in mouse models used for the study of the aforementioned human diseases becomes a necessity. First in this study, active recombinant mouse Klk6 protein was produced in Pichia pastoris KM71. The cDNA encoding for the mature mouse Klk6 protein was obtained by RT-PCR from RNA extracted from mouse C57BL6 brain. The PCR product was digested with XhoI and EcoRI, purified and subsequently cloned into the pPIC9 expression vector. The methylotrophic yeast strain Pichia Pastoris KM71 was transformed with the pPIC9/mature Klk6 construct, linearized with SalI, with the spheroplast method. Recombinant yeast clones transformed with the expression construct pPIC9/mature Klk6 were identified, confirmed by DNA sequencing and grown in liquid culture for recombinant protein production. Recombinant Klk6 was isolated from the yeast culture supernatant and was purified by hydrophobic interaction chromatography (HIC). The yield of recombinant protein production was 4.16 mg/lt culture after purification. Then, rKlk6 was characterized, in terms of proteolytic activity, by gelatin and casein zymography and by digestion of chromogenic synthetic peptide substrates and protein substrates. Νo antibody is currently available that is highly specific for mouse Klk6. Here, a novel rabbit anti-peptide polyclonal for mouse Klk6 was generated. Peptides corresponding to two non-overlapping Klk6 sequences of high hydrophilicity and predicted antigenicity were synthesized, conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH) and used for immunization. The specificity and affinity of the purified polyclonal was assessed against active recombinant mouse Klk6 protein produced in Pichia pastoris KM71 as described, and the detection limit was determined at 50 ng by Western blot. Finally, the expression of Klk6 in mouse tissues was analyzed by semi-quantitative RT-PCR using gene-specific primers. Using whole extracts of Klk6 expressing mouse tissues, we showed that the purified anti-Klk6 polyclonal (IgG fraction) recognizes the endogenous Klk6 protein with a high sensitivity and specificity. Conclusively, the produced αντι-Klk6 polyclonal should be a valuable tool in studies employing mouse models in order to decipher the putative role(s) of Klk6 in signaling pathways involved in major human diseases, such as the multiple sclerosis and Parkinson’s disease.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 μπορεί να ενεργοποιηθεί φαρμακολογικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός της ενεργοποίησης. Το cDNA της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 αρχικά κλωνοποιήθηκε με την τεχνική της διαφορικής παράθεσης των mRNAs βάσει της υπερέκφρασης σε πρωτοπαθή όγκο μαστού σε σχέση με την πλήρη αποσιώπηση στην μετάστασή του στον πνεύμονα, καθώς και στις περισσότερες μεταστατικές καρκινικές σειρές μαστού και δείγματα ιστών. Λόγω της καταστολής της έκφρασής της σε μεταστατικούς όγκους του μαστού, θεωρήθηκε ότι η κωδικοποιούμενη πρωτεΐνη (hK6)-μια νέα σερινοπρωτεάση- θα μπορούσε να έχει ογκοκατασταλτική δράση. Πρόσφατα δεδομένα δείχθουν ότι η hK6 αντιπροσωπεύει έναν νέο μοριακό δείκτη του καρκίνου, αφού αυξημένες συγκεντρώσεις της στον ορό είναι διαγνωστικές για τον καρκίνο των ωοθηκών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της θεραπευτικής αγωγής. Οι φυσιολογικές λειτουργίες της hK6 δεν έχουν βρεθεί. Πρόσφατα, αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου KLK6 έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση των πιο κοινών νευροεκφυλιστικών νόσων, όπως Alzheimer’s και Parkinson’s. Σημαντικό, είναι το γεγονός της αποικοδόμησης της μυελίνης από την hK6, που πιστοποιεί την συμμετοχή της στην σκλήρυνση κατά πλάκας. Για τους παραπάνω λόγους η hK6, καθώς και το γονίδιο KLK6 αποτελούν ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Στην παρούσα εργασία, δείχθηκε ότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την μεταγραφή καθώς και την ιστο-εξειδικευμένη έκφραση του γονιδίου KLK6 περιλαμβάνουν την δραστικότητα δύο υποκινητών. Επίσης κλωνοποιήθηκαν νέες ισομορφές του γονιδίου που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και αντιστοιχούν στο 10-20% των KLK6 mRNAs. Προηγούμενη έρευνα δεν είχε παρατηρήσει εκτεταμένες γονιδιωματικές αλλαγές σε καρκινικούς όγκους στην γενετικό τόπο 19q13.4 που εδρεύει το γονίδιο KLK6, και σε συνδυασμό με την πιθανή ογκοκατασταλτική δράση της hK6, διερευνήθηκε η συμμετοχή επιγενετικών μηχανισμών στην αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6. Κατεργασία των καρκινικών κυτταρικών σειρών μαστού T47D και MDA-MB-231 με το απομεθυλιωτικό αντιδραστήριο 5-αζα-2΄-δεοξυκυτιδίνη επανενεργοποίησε την έκφραση του γονιδίου KLK6. Η τριχοστατίνη Α, αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, επανενεργοποίησε την έκφραση KLK6 μόνο στα MDA-MB-231 κύτταρα. Επίσης, βρήκαμε ότι η καταστολή της έκφρασης KLK6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού συνδέεται με την μεθυλίωση συγκεκριμένων δινουκλεοτιδικών αλληλουχιών CpGs που βρίσκονται στον εγγύς υποκινητή του γονιδίου και σε θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Η αποσιώπηση της έκφρασης λαμβάνει χώρα με την πρόσδεση του εξαρτώμενου από μεθυλίωση μεταγραφικού καταστολέα MeCP2 και την δημιουργία ετεροχρωματινικής δομής λόγω αποακετυλίωσης των ιστονών. Επειδή η επιγενετική αποσιώπηση του γονιδίου KLK6 υποδηλώνει ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού, διαμολύνθηκε σταθερά το KLK6 cDNA στην μεταστική σειρά MDA-MB-231 με σκοπό τη διαπίστωση του πιθανού αυτού ρόλου. Τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα που προέκυψαν, είχαν μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, ενώ δεν μπορούσαν να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο KLK6 αποτελεί πιθανό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που αποσιωπάται σε καρκινικές σειρές μαστού μέσω μεθυλίωσης του γονιδιωματικού DNA, καθώς και δημιουργίας ετεροχρωματινικής δομής στον εγγύς υποκινητή του. Η φαρμακολογική ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6 μέσω επιγενετικών φαρμάκων, είναι πιθανό να ανοίξει νέους δρόμους για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. / In the present thesis it was shown that the human kallikrein 6 gene is pharmacologically modulated in breast cancer cell lines and the molecular mechanism accounting for the modulation was analyzed. The cDNA encoding human kallikrein 6 (protease M) was originally cloned by mRNA differential display as being over expressed in a primary breast tumor but completely inactivated in its lung metastasis, and in the majority of metastatic breast cancer cell lines and tissue specimens. Based on this expression pattern, it was suggested that the encoded protein (hK6)-a novel serine protease-could play a suppressor role in cancer progression. Recent evidence suggests that hK6 represents a novel cancer biomarker, since elevated serum concentrations of hK6 are diagnostic of ovarian cancer and can be exploited for monitoring therapeutic response to treatment. The physiological function(s) of hK6 have not been elucidated. Recently, aberrant expression of the KLK6 gene has been implicated in the pathogenesis of most common neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In addition, hK6 is involved in enhanced proteolysis of myelin basic protein associated with multiple sclerosis. Therefore, hK6 and KLK6 gene, represent potential therapeutic targets for pharmacological intervention. In the present study, we have shown that the mechanisms regulating KLK6 transcription and tissue-specific expression involve the action of two different promoters. Also, new KLK6 splice variants were cloned, and shown to account for 10-20% of all KLK6 mRNA species. Previous study had shown no gross genomic alterations in tumor speciments in the KLK6 genomic locus 19q13.4, and in accordance with putative tumor suppressor activity the involvement of epigenetic mechanisms in KLK6 gene silencing in breast cancer was studied. Treatment of KLK6-negative T47D and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines with the demethylating agent 5-aza-2\\\\\\\\