Um método baseado na extração de rRNA, seguido de RT-PCR rRNA 16S, clonagem e ARDRA foi otimizado e validado para a identificação das bactérias ativas em biofilmes. O método foi analisado primeiro com consórcios artificiais de três organismos. As etapas de clonagem e RT não causaram variações importantes na composição destes consórcios, do contrário da etapa de PCR, onde foi necessária a redução de 30 para 10 ciclos para limitar a distorção da proporção de templates. A análise de biofilmes reais indicou que clones dominantes podem ser identificados com o critério de ocorrência de >2% na biblioteca, mas que a reprodutibilidade de análises ainda é insatisfatória, possivelmente devido a fatores como a micro heterogeneidade espacial do biofilme, viés na reação de PCR e formação de mais de um clone de ARDRA por organismo. O armazenamento do biofilme a -20 °C por 2 meses não levou à alterações expressivas em sua composição. O perfil de clones detectado com o kit (Mo Bio) de extração de RNA foi muito diferente do perfil detectado com o método otimizado neste trabalho. / A method based on extraction of rRNA, followed by RT-PCR of 16S rRNA, cloning and ARDRA was optimized and validated for identification of bacteria active in biofilms. The method was first tested with artificial three-membered consortia. Cloning and RT did not lead to significant changes in the composition of the artificial consortia, but a reduction in cycle number in the PCR reaction from 30 to 10 was necessary for limiting the distortion in the proportion of amplicons relative to that of the templates. Analysis of real biofilms revealed that clones from active organisms occurred in frequencies >2% in the clone library, but reproducibility of analysis was unsatisfactory, probably due to factors such as the spatial heterogeneity of colonization of biofilms by microbes, PCR bias and more than one ARDRA clone per organism. Storage of biofilm samples at -20 °C for 2 months did not lead to important changes in composition. Very different clone profiles were obtained in the analysis of the same biofilm sample with the optimized method and with a kit (Mo Bio) for extraction of RNA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14082009-111609 |
| Date | 14 April 2009 |
| Creators | Almeida, Roberta Novaes Amorim |
| Contributors | Schneider, Rene Peter |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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