A terapia gênica por RNA de interferência (RNAi) trata-se de um processo de silenciamento pós-transcricional capaz de suprimir a expressão de um determinado gene. No entanto, para se tornar eficaz, a terapia gênica utilizando siRNA (small interfering RNA - siRNA) é dependente de uma eficiente liberação e expressão do acido nucléico nas células-alvo dentro dos tecidos ou órgãos. A literatura atual mostra algumas propostas de sistemas de liberação tópica de siRNA, entretanto, o uso de nanopartículas híbridas polimérico-lipídicas para complexação e liberação de siRNA na pele para o tratamento tópico de doenças cutâneas, ainda é pouco explorado, o que configura a inovação deste trabalho. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de uma nanopartícula hibrida lipídica associada a um polímero catiônico (NLS-PEI) como sistema de liberação tópica para siRNA, visando a terapia gênica como nova abordagem no tratamento de patologias cutâneas. Primeiramente a composição e o método de produção das NLS-PEI foram otimizados. Como polímero catiônico, utilizou-se a polietilenoimina (PEI). As NLS-PEIs otimizadas, compostas pelo lipídeo Compritol® 888 ATO (2,0%), Poloxamer 188 (1,5%) e PEI (0,15 e 0,25%), apresentaram-se esféricas com superfície lisa e um tamanho médio de 165 nm, potencial zeta médio de +20 mV, concentração de partículas de 1013/mL e com alta estabilidade (90 dias a 4°C). Foi demonstrado, por DSC, que a PEI interage tanto com o tensoativo na superficie das nanoparticulas como também com o lipídeo. A avaliação de comportamento e ação in vitro das NLS-PEIs foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento não diminuiu a viabilidade celular e houve alta captação verificada por citometria de fluxo (acima de 80% de células transfectadas) e por microscopia confocal. No estudo in vitro de penetração das NLS-PEI complexado com siRNA-FAM em pele de orelha de porco, foi demonstrado a penetração cutânea aumentada de siRNA-FAM a partir das NLS-PEIs. Ensaio in vivo em modelo de inflamação cutânea aguda e crônica mostrou a eficácia das NLS-PEIs contendo siTNF-?, reduzindo a espessura da epiderme em comparação ao grupo controle, reduzindo o rubor, a descamação e os níveis da citocina pró-inflamatória TNF-? e seu RNAm correspondente. A NLS-PEI também promoveu a penetração cutânea das moléculas de siRNA nas camadas mais profunda da pele, in vivo. Diante dos resultados obtidos, podese concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação promissores para administração tópica de siRNA para o tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica. / Small-interfering RNA (siRNA) has a high application potential for therapeutic silencing of pathologic or drug-resistance genes. Nonetheless, free siRNA molecules are known to have poor transfection efficiency and biological stability, so a carrier use is necessary. Lipid-polymeric nanocarriers are the new generation of nanoparticulate that have been used as siRNA carrier system and are attracting attention as novel colloidal drug carrier for topical use. In this context, the aim of this study was to develop of hybrid lipidpolyethylenimine nanocarriers (SLN-PEI) as topical delivery systems for siRNA. First, the SLN-PEI composition and production method were optimized. Polyethyleneimine (PEI) was used as cationic polymer. The optimized SLN-PEIs, composed of the lipid Compritol® 888 ATO (2.0%), Poloxamer 188 (1.5%) and PEI (0.15 and 0.25%), were spherical with a smooth surface and average size of 200 nm, mean zeta potential of +20 mV, mean number of particles per mL in the 1013 frame and remained stable for 90 days at 4 °C. It has been demonstrated by DSC that PEI interacts with both the surface surfactant of the nanoparticles and with the lipid. The evaluation SLN-PEI\'s behavior and in vitro action was studied in keratinocytes and fibroblasts, evidencing that the nanoparticles did not decrease cell viability and there was high cellular uptake evidenced by flow cytometry (above 80% of transfected cells) and by confocal microscopy. In the permeation in vitro study, it was demonstrated that SLN-PEI increased cutaneous penetration of siRNA-FAM. In vivo assay, in model of acute and chronic skin inflammation, demonstrated the efficacy of SLN-PEIs carrying siTNF-?, reducing epidermal thickness compared to control group, reducing redness, desquamation and levels of the pro-inflammatory cytokine TNF- ? and its corresponding mRNA. SLN-PEI also promoted penetration of the siRNA molecules in the deeper layers of the skin, in vivo. In view of the results obtained, we can conclude that the formulations developed are promising delivery systems for topical administration of siRNA for the treatment of cutaneous pathologies in gene therapy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22052018-160337 |
| Date | 16 November 2017 |
| Creators | Araujo, Margarete Moreno de |
| Contributors | Bentley, Maria Vitoria Lopes Badra, Gaspari, Priscyla Daniely Marcato |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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