A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial de seu sistema de regulação iônica e osmótica. Esta enzima também apresenta um papel relevante no processo de excreção ativa de NH4+ através do tecido branquial dos crustáceos. Uma fração microsomal rica em (Na+, K+)ATPase foi preparada por centrifugação diferencial a partir de um homogeneizado do tecido branquial de Callinectes ornatus. A centrifugação em gradiente de sacarose revelou a presença de um unico pico de proteina com atividade ATPase, mas a eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes revelou a presença de várias bandas protéicas. O uso do anticorpo monoclonal 5 contra a subunidade da (Na+, K+) ATPase, revelou a presença de uma única banda proteica de 110 kDa com atividade (Na+, K+)?ATPase. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o PNPP (V= 52,0 ± 2,0 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,1 mM) através de interações sítio-sítio (nH= 1,6). A modulação da enzima pelos íons magnésio (V= 52,3 ± 1,3 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,05 mM), potássio (V= 51,4 ± 1,5 U/mg e K0,5 = 2,3 ± 0,1 mM) e amônio (V= 56,7 ± 2,6 U/mg e K0,5 = 9,8 ± 0,4 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. Os íons sódio atuaram como inibidores da atividade K+-fosfatase da enzima (Ki= 1,7 ± 0,1 mM) e a ouabaína inibiu cerca de 80% a atividade PNPPase independentemente da presença de íons amônio. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o ATP de acordo com cinética de Michelis-Menten, com KM= 0,16 0,01 mM e V= 116,3 5,6 U/mg, enquanto a modulação da atividade da enzima pelos íons magnésio (V= 111,0 ± 5,4 U/mg e K0,5= 0,54 ± 0,03 mM), sódio (V= 110,6 ± 5,3 U/mg e K0,5= 6,3 ± 0,3 mM), potássio (V= 116,0 ± 5,5 U/mg e K0,5= 1,5 ± 0,1 mM) e amônio (V= 173,3 ± 5,4 U/mg e K0,5= 5,4 ± 0,3 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio. Também foi observado que na presença de concentrações crescentes de ions amonio, a estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo íons potássio acarretou um aumento de 50% na atividade específica da enzima. A ouabaína inibiu cerca de 86% a atividade (Na+,K+)-ATPase com Ki= 74,5 ?M, sugerindo a presença de 14% de fosfatases e/ou outras ATPase contaminantes. Este é o primeiro trabalho onde se observa uma estimulação sinergística da atividade K-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase de crustáceo pelos íons potássio e amônio. Os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de Callinectes ornatus, analisados em conjunto com os já descritos para outras espécies de crustáceos poderão abrir novas perspectivas em relação ao papel dessa enzima na adaptação fisiológica-bioquímica, bem como para a sobrevivência desses animais em diferentes ambientes. / (Na+, K+)-ATPase present on branchial tissue osmoregulatory crustaceans is an essential component of their osmotic and ionic regulation system. Apparently, this enzyme also have a relevant role in the active excretion de NH4+ through the branchial crustacean tissue. A (Na+, K+) ATPase-rich microsomal fraction was prepared by differential centrifugation from Callinectes ornatus homogenized branchial tissue. The sucrose gradient sucrose centrifugation showed the presence of a single protein peak with ATPase activity, and SDS-PAGE revealed the presence of several proteins bands. The use of the 5 monoclonal antibody, against the ? subunit, revealed the presence of a unique protein band of 110 kDa corresponding to the (Na+, K+) ATPase. (Na+, K+) ATPase hydrolyzed the PNPP (V= 52.0 2.0 U/mg and K0.5= 1.1 0.1 mM) through the site-site interactions (nH= 1.6). The modulation of (Na+, K+) ATPase by magnesium (V= 52.3 1.3 U/mg and K0.5= 1.1 ? 0.05 mM), potassium (V= 51.4 1.5 U/mg and K0.5= 2.3 0.1 mM) and ammonia ions (V= 56.7 2.7 U/mg and K0.5= 9.8 ? 0.4 mM) followed cooperative kinetics. However, sodium ions inhibited PNPPase activity of (Na+, K+)?ATPase with Ki= 1.7 0.1 mM. Ouabain also inhibited up to 80% the total activity PNPPase independent of the presence of ammonium ions. The hydrolysis of ATP by (Na+, K+) ATPase followed Michaelis-Menten kinetics with Km= 0.16 0.01 mM and V= 116.3 5.6 U/mg, while enzyme modulation by magnesium (V= 111.0 5.4 U/mg and K0.5= 0.54 0.03 mM), sodium (V= 110.6 5.3 U/mg and K0.5= 6.3 0.3 mM), potassium (V= 116.0 5.5 U/mg and K0.5= 1.5 ? 0.1 mM) and ammonium ions (V= 173.3 . Interestingly, the stimulation of (Na+, K+)-ATPase activity by potassium ions in the presence of increasing concentration of ammonium ions to K+ resulted in a 50% higher specific activity. Ouabain inhibited approximately 86% the activity (Na+, K+) ATPase with (Ki= 74.5 M), suggesting the presence of about 14% of phosphatases and/or other ATPases. This is the first work showing synergistic stimulation of crustacean (Na+, K+) ATPase by potassium and ammonium ions when PNPP is used a substrate. The results reported herein for Callinectes ornatus branchial (Na+, K+) ATPase might open new perspectives concerning the physiological adaption and the survival of these animals in different environmental.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24042007-154908 |
| Date | 09 March 2007 |
| Creators | Garçon, Daniela Pereira |
| Contributors | Leone, Francisco de Assis |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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