O transporte de α-metil glicosídio ( α-MG) em Saccharomyces cerevisiae foi recentemente reportado como transporte ativo, do tipo simporte de &$945;-MG com H+ mediado pela permease Agt1p. A cepa AP77-11B (cepa selecionada em nosso laboratório) 14C-α-MG pelo mecanismo descrito como difusão facilitada porque não existe co-transporte de H+ durante o transporte de α-MG. Os genes HXT1-HXT17 pertencem à família dos transportadores de hexoses em Saccharomyces cerevisiae. Então, nós decidimos investigar a possibilidade que o transporte de α-MG poderia ser mediado pelos transportadores de hexoses. Nós demonstramos que cepa MC966A (tipo selvagem), KY73 (isogênica com MC966A mas deletada nos HXT1-7), BSY08 (isogênica com KY73 com o AGT1 deletado), BSY09 (isogênica com MC966A com o AGT1 deletado) e a EBY.VW4000 (hxt1-17 agt1 gal2-null), não cresceram em α-MG como fonte de carbono. Além disso, estas cepas não transportaram α-MG por difusão facilitada quando as células foram cultivadas em meio com maltose, levando-nos a concluir que os transportadores de hexoses não estavam envolvidos no transporte de α-MG. Nós observamos que a cepa AP77-11B apresentou alta atividade de α-metilglicosidase periplásmica quando as células foram cultivadas em α-MG. Esta atividade enzimática foi ensaiada usando um método descrito primeiramente para invertase periplásmica, no qual as células eram incubadas com fluoreto de sódio, um inibidor da enolase, antes da incubação com α-MG. Então, a glicose produzida durante a hidrólise do -MG poderia ser determinada. A atividade extracelular só está presente em células cultivadas em -αMG. Células de-reprimidas não mostraram atividade de alpha-metilglicosidase. Os parâmetros cinéticos determinados para α-metilglicosidase, indicaram que esta enzima tem baixa afinidade para o alpha-MG. Além do mais, a atividade específica da alpha-metilglicosidase periplásmica aumentou ao longo da curva de crescimento em α-MG. Os resultados reportados mostraram que existem duas vias de utilização de α-MG em Saccharomyces cerevisiae. Uma via é mediada pela Agt1p, responsável pelo transporte ativo de α-MG. Na outra via, a α -metilglicosidase é secretada para o espaço periplásmico das células. Então, a glicose produzida pela hidrólise do α-MG é transportada pelos transportadores de hexoses por difusão facilitada. / Alpha-Methyl glucoside ( alpha-MG) transport in Saccharomyces cerevisiae was previously reported to be an active transport, a H+ -symport mediated by the Agt1p permease. Strain AP77-11B (a strain obtained in our laboratory) takes up 14C- alpha-MG by a mechanism which was ascribed to be facilitated diffusion since there is no H+-cotransport during the alpha-MG uptake. The HXT1-HXT17 there is no H genes belong to a family of hexose transporters in Saccharomyces cerevisiae. Therefore, we decided to investigate the possibility that -MG transport could be mediated by hexose transporters. We demonstrated that strains MC966A (w.t.), KY73 (isogenic to MC966A but hxt1-hxt7-null), BSY08 (isogenic to KY73 with AGT1 deleted), BSY09 (isogenic to MC966A with AGT1 deleted) and even strain EBY.VW4000 (hxt1-hxt17 agt1 gal2-null), were not able to grow on alpha-MG as the sole carbon source. Moreover, none of them presented alpha-MG transport by facilitated diffusion when the strains were grown on maltose leading us to conclude that the HXT glucose transporters were not involved in alpha-MG transport. We found that strain AP77-11B displayed a high periplasmic alpha-methylglucosidase activity when cells were grown on alpha-MG. This enzymatic activity was assayed using a method first described for periplasmic invertase in which cells were incubated with sodium fluoride, an inhibitor of enolase, prior to the incubation with alpha-MG. Then the glucose produced during alpha-MG hydrolysis could be accurately measured. The extracellular activity was present only in cells grown on alpha-MG. Glucose derepressed cells did not show periplasmic alpha-methylglucosidase activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30012008-140526 |
| Date | 07 December 2007 |
| Creators | Silva, Marcia Aparecida da |
| Contributors | Araujo, Pedro Soares de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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