A literatura têm indicado que a via metabólica de degradação de amido em bananas é regulada tanto por etileno quanto por auxinas, dentre outros fatores. Visando melhor entender o mecanismo pelo qual isso ocorre, acompanhou-se o amadurecimento de bananas infiltradas com ácido indol-3-acético (AIA) utilizando um modelo de infiltração do hormônio em fatias do fruto. Foram avaliados os níveis de AIA endógeno, a evolução na degradação de amido e síntese de açúcares solúveis, a ocorrência de alterações na transcrição e atividade das enzimas β-amilase e DPE2 e a possível correlação destes eventos com alterações na via de transdução de sinal de etileno - hormônio reconhecidamente responsável por desencadear a ativação do metabolismo degradatório de amido durante o amadurecimento. Nos frutos tratados com AIA, os resultados apontaram atraso na degradação de amido e no acúmulo de açúcares solúveis; as variações nos níveis de atividade e de transcritos de β-amilase nos grupos controle e tratado foram semelhantes; contudo, no grupo tratado a evolução destes processos ocorreu com atraso em relação ao controle. Os níveis de transcritos de DPE2, mais expressivos no início do amadurecimento em ambos os grupos, foram sustentados por mais tempo nos frutos tratados; a atividade, no entanto, parece ter sido sensivelmente inibida pelo tratamento com AIA. Os perfis de transcritos dos receptores de etileno ERS3 e ETR1 apontam que os mesmos foram fortemente afetados pelo tratamento. Assim, os resultados sugerem que modificações no padrão de sinalização do etileno podem ser parte do mecanismo pelo qual AIA afeta o perfil de transcritos e atividade de β-amilase e DPE2, provocando, em consequência, atraso no processo de mobilização da reserva de amido na banana e também na síntese de açúcares. / The literature indicates that the starch degradation in bananas is probably regulated by ethylene and auxins, among other factors. To understand the mechanisms involved, we followed the ripening of banana slices infiltrated with indole-3-acetic acid (AIA). We measured the evolution of endogenous AIA levels and starch degradation, as well as shifts in transcription and activity of β-amilase and DPE2 and their possible correlation with alterations in the ethylene signal transduction path. In AIA-treated slices, results indicated delay in starch degradation and acummulation of soluble sugars; the changes in β-amilase transcripts and activity levels in control and treated groups were similar, although they were delayed for the AIA-treated group, when compared to control. DPE2 transcript levels, stronger in the earlier stages of rippening in both groups, were sustained longer in AIA-treated bananas; on the other hand, its activity seems to has been severely inhibited by the AIA treatment. The transcript profiles of ERS3 and ETR1 ethylene receptors indicate that they were both strongly affected by the treatment. In this way, the results sugest that modifications in the ethylene signaling pathway may be part of the mechanism by which high level of AIA affects the profile of transcripts and activities of β-amilase and DPE2, inducing the delay in the mobilization of the starch reserve of the bananas, as well as the sugar synthesis.

A literatura têm indicado que a via metabólica de degradação de amido em bananas é regulada tanto por etileno quanto por auxinas, dentre outros fatores. Visando melhor entender o mecanismo pelo qual isso ocorre, acompanhou-se o amadurecimento de bananas infiltradas com ácido indol-3-acético (AIA) utilizando um modelo de infiltração do hormônio em fatias do fruto. Foram avaliados os níveis de AIA endógeno, a evolução na degradação de amido e síntese de açúcares solúveis, a ocorrência de alterações na transcrição e atividade das enzimas β-amilase e DPE2 e a possível correlação destes eventos com alterações na via de transdução de sinal de etileno - hormônio reconhecidamente responsável por desencadear a ativação do metabolismo degradatório de amido durante o amadurecimento. Nos frutos tratados com AIA, os resultados apontaram atraso na degradação de amido e no acúmulo de açúcares solúveis; as variações nos níveis de atividade e de transcritos de β-amilase nos grupos controle e tratado foram semelhantes; contudo, no grupo tratado a evolução destes processos ocorreu com atraso em relação ao controle. Os níveis de transcritos de DPE2, mais expressivos no início do amadurecimento em ambos os grupos, foram sustentados por mais tempo nos frutos tratados; a atividade, no entanto, parece ter sido sensivelmente inibida pelo tratamento com AIA. Os perfis de transcritos dos receptores de etileno ERS3 e ETR1 apontam que os mesmos foram fortemente afetados pelo tratamento. Assim, os resultados sugerem que modificações no padrão de sinalização do etileno podem ser parte do mecanismo pelo qual AIA afeta o perfil de transcritos e atividade de β-amilase e DPE2, provocando, em consequência, atraso no processo de mobilização da reserva de amido na banana e também na síntese de açúcares. / The literature indicates that the starch degradation in bananas is probably regulated by ethylene and auxins, among other factors. To understand the mechanisms involved, we followed the ripening of banana slices infiltrated with indole-3-acetic acid (AIA). We measured the evolution of endogenous AIA levels and starch degradation, as well as shifts in transcription and activity of β-amilase and DPE2 and their possible correlation with alterations in the ethylene signal transduction path. In AIA-treated slices, results indicated delay in starch degradation and acummulation of soluble sugars; the changes in β-amilase transcripts and activity levels in control and treated groups were similar, although they were delayed for the AIA-treated group, when compared to control. DPE2 transcript levels, stronger in the earlier stages of rippening in both groups, were sustained longer in AIA-treated bananas; on the other hand, its activity seems to has been severely inhibited by the AIA treatment. The transcript profiles of ERS3 and ETR1 ethylene receptors indicate that they were both strongly affected by the treatment. In this way, the results sugest that modifications in the ethylene signaling pathway may be part of the mechanism by which high level of AIA affects the profile of transcripts and activities of β-amilase and DPE2, inducing the delay in the mobilization of the starch reserve of the bananas, as well as the sugar synthesis.

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a α-amilase, a β-amilase, as amido-fosforilases, as α-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da β-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da β-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZαA com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de β-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução. / One of the most important events that occurs during ripening of banana is the starch degradation concomitantly with the accumulation of soluble sugars. Several enzymes, known by acting on starch degradation, had their activity and/or specific protein detected at this stage of banana. These include the α-amylase, the β-amylase, the starch-phosphorylases, the α-glucosidase and the isoamilases. The synthesis and starch degradation occur inside of the amyloplast that contain two membranes which has to be reach before accessing the starch granule or the products of the other enzymes. One of the isoforms of β-amylase in bananas has a transit peptide predicted in the sequence, required to access the amyloplast. To establish the real importance of each enzyme in the starch degradation it is necessary to isolate the granules and enzymes and submit them to the sequential activity to confirm the supposed degradation. The idea is to use the endogenous enzyme, but the process of purification of the enzyme in fruits demands a lot of time and the results of purity, quantity and activity are not guaranteed. Studies based on heterologous expression of the β-amylase genes allow us to understand the mechanisms of action of this enzyme present in the pulp of banana. Thus, tests were carried out with heterologous expression in Pichia pastoris in order to produce this enzyme in sufficient quantity to purification, and then, applied on starch granules and produce a polyclonal antibody. We tested different conditions of protein induction such as aeration, temperature, pH, methanol concentration and induction time, as well as the new genic construction with the histidine tag with an expression vector pPICZαA confirming the phenotype of positive transformants. However, recombinant β-amylase with activity was not obtained successfully, necessitating changes in these patterns of induction.

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a α-amilase, a β-amilase, as amido-fosforilases, as α-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da β-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da β-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZαA com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de β-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução. / One of the most important events that occurs during ripening of banana is the starch degradation concomitantly with the accumulation of soluble sugars. Several enzymes, known by acting on starch degradation, had their activity and/or specific protein detected at this stage of banana. These include the α-amylase, the β-amylase, the starch-phosphorylases, the α-glucosidase and the isoamilases. The synthesis and starch degradation occur inside of the amyloplast that contain two membranes which has to be reach before accessing the starch granule or the products of the other enzymes. One of the isoforms of β-amylase in bananas has a transit peptide predicted in the sequence, required to access the amyloplast. To establish the real importance of each enzyme in the starch degradation it is necessary to isolate the granules and enzymes and submit them to the sequential activity to confirm the supposed degradation. The idea is to use the endogenous enzyme, but the process of purification of the enzyme in fruits demands a lot of time and the results of purity, quantity and activity are not guaranteed. Studies based on heterologous expression of the β-amylase genes allow us to understand the mechanisms of action of this enzyme present in the pulp of banana. Thus, tests were carried out with heterologous expression in Pichia pastoris in order to produce this enzyme in sufficient quantity to purification, and then, applied on starch granules and produce a polyclonal antibody. We tested different conditions of protein induction such as aeration, temperature, pH, methanol concentration and induction time, as well as the new genic construction with the histidine tag with an expression vector pPICZαA confirming the phenotype of positive transformants. However, recombinant β-amylase with activity was not obtained successfully, necessitating changes in these patterns of induction.