A Cubebina (CB) é uma lignana da classe das dibenzilbutirolactonas presente em uma ampla variedade de espécies vegetais espalhadas pelo mundo. Nos últimos anos, vários estudos têm demonstrado seu potencial para o tratamento de doenças como Leishmaniose e Doença de Chagas, além de possuir ação antiinflamatória e analgésica. Entretanto, apesar da CB apresentar diversas potencialidades terapêuticas, sua utilização ainda é limitada devido à sua baixa solubilidade em água, que compromete sua biodisponibilidade. Os dendrímeros são estruturas quase esféricas, de dimensão nanométrica, com grande número de subgrupos funcionais reativos e espaços interiores protegidos. São capazes de complexar com moléculas e, dessa forma, aumentar a solubilidade do fármaco. De forma semelhante, as ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos que possuem a capacidade de interagir com moléculas hidrofóbicas através de sua cavidade que também é hidrofóbica. Isso as torna capazes de aumentar a solubilidade de fármacos pouco solúveis aumentando sua biodisponibilidade. Nesse trabalho foram obtidos complexos dessas macromoléculas com a CB por diferentes métodos. Metodologias de quantificação da CB, nas formas livre e complexada, foram desenvolvidas utilizando técnicas de espectrofotometria e de cromatografia líquida de alta eficiência. Esses sistemas foram caracterizados utilizando técnicas apropriadas como estudos de solubilidade de fase, espectroscopia no IV, difração de raios X, RMN H1 e simulações de modelagem e dinâmica molecular. Os resultados demonstraram que tanto os dendrímeros quanto as ciclodextrinas são capazes de gerar complexos solúveis com a CB sendo os melhores resultados obtidos com a HP--CD. Os resultados desse trabalho permitiram concluir que tanto dendrímeros quanto CDs são estruturas adequadas e promissoras para a veiculação da CB, aumentando assim o seu potencial para aplicações biológicas, visando o tratamento de diversas patologias. / Cubebin (CB) is a lignan from the class of dibenzylbutyrolactones present in a wide variety of plant species around the world. Its known for its anti-inflammatory and analgesic effects. In recent years, several studies have demonstrated its potential to treat diseases such as leishmaniasis and Chagas. Although the CB shows several potential therapeutics, its use is still limited due to its low water solubility which compromises its bioavailability. The dendrimers are nearly spherical structures, nanometer-sized, with large number of reactive functional groups and protected inner. They are capable of complexing with molecules and thereby increase the solubility of the drug. Similarly, cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides that have the ability to interact with hydrophobic molecules through the cavity which is also hydrophobic. This makes them capable of increasing the solubility of poorly soluble drugs by increasing their bioavailability. In this work, complexes of macromolecules with CB were obtained by different processes. Methodologies for quantification of free and complexed CB were developed by spectrophotometry and high performance liquid chromatography. Moreover, these systems were characterized by techniques such Phase Solubility Studies, IR spectroscopy, X-ray diffraction, NMRH1, modeling and molecular dynamics simulation. The results showed that both dendrimers and cyclodextrins are capable to form soluble complexes with CB. Best results were obtained with HP--CD. The findings of this study indicate that both dendrimers and CDs are appropriated structures to release the CB and also increase its potential for biological applications, focusing on the treatment of various diseases.

A Cubebina (CB) é uma lignana da classe das dibenzilbutirolactonas presente em uma ampla variedade de espécies vegetais espalhadas pelo mundo. Nos últimos anos, vários estudos têm demonstrado seu potencial para o tratamento de doenças como Leishmaniose e Doença de Chagas, além de possuir ação antiinflamatória e analgésica. Entretanto, apesar da CB apresentar diversas potencialidades terapêuticas, sua utilização ainda é limitada devido à sua baixa solubilidade em água, que compromete sua biodisponibilidade. Os dendrímeros são estruturas quase esféricas, de dimensão nanométrica, com grande número de subgrupos funcionais reativos e espaços interiores protegidos. São capazes de complexar com moléculas e, dessa forma, aumentar a solubilidade do fármaco. De forma semelhante, as ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos que possuem a capacidade de interagir com moléculas hidrofóbicas através de sua cavidade que também é hidrofóbica. Isso as torna capazes de aumentar a solubilidade de fármacos pouco solúveis aumentando sua biodisponibilidade. Nesse trabalho foram obtidos complexos dessas macromoléculas com a CB por diferentes métodos. Metodologias de quantificação da CB, nas formas livre e complexada, foram desenvolvidas utilizando técnicas de espectrofotometria e de cromatografia líquida de alta eficiência. Esses sistemas foram caracterizados utilizando técnicas apropriadas como estudos de solubilidade de fase, espectroscopia no IV, difração de raios X, RMN H1 e simulações de modelagem e dinâmica molecular. Os resultados demonstraram que tanto os dendrímeros quanto as ciclodextrinas são capazes de gerar complexos solúveis com a CB sendo os melhores resultados obtidos com a HP--CD. Os resultados desse trabalho permitiram concluir que tanto dendrímeros quanto CDs são estruturas adequadas e promissoras para a veiculação da CB, aumentando assim o seu potencial para aplicações biológicas, visando o tratamento de diversas patologias. / Cubebin (CB) is a lignan from the class of dibenzylbutyrolactones present in a wide variety of plant species around the world. Its known for its anti-inflammatory and analgesic effects. In recent years, several studies have demonstrated its potential to treat diseases such as leishmaniasis and Chagas. Although the CB shows several potential therapeutics, its use is still limited due to its low water solubility which compromises its bioavailability. The dendrimers are nearly spherical structures, nanometer-sized, with large number of reactive functional groups and protected inner. They are capable of complexing with molecules and thereby increase the solubility of the drug. Similarly, cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides that have the ability to interact with hydrophobic molecules through the cavity which is also hydrophobic. This makes them capable of increasing the solubility of poorly soluble drugs by increasing their bioavailability. In this work, complexes of macromolecules with CB were obtained by different processes. Methodologies for quantification of free and complexed CB were developed by spectrophotometry and high performance liquid chromatography. Moreover, these systems were characterized by techniques such Phase Solubility Studies, IR spectroscopy, X-ray diffraction, NMRH1, modeling and molecular dynamics simulation. The results showed that both dendrimers and cyclodextrins are capable to form soluble complexes with CB. Best results were obtained with HP--CD. The findings of this study indicate that both dendrimers and CDs are appropriated structures to release the CB and also increase its potential for biological applications, focusing on the treatment of various diseases.

A doença de Chagas, transmitida pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta mais de 18 milhões de pessoas na América Latina e mesmo tendo sido descrita há 100 anos por Carlos Chagas, esta ainda representa um importante problema de saúde pública, sendo encontrados casos em 18 países em desenvolvimento na América do Sul e Central. No Brasil, o benzonidazol, (ROCHAGAN), é a única droga de atividade tripanocida disponível no mercado mesmo apresentando vários efeitos colaterais e limitada eficácia na fase crônica da infecção. Em vista da necessidade de novas substâncias com atividade biológica sobre T.cruzi, o interesse pela pesquisa vem crescendo com o intuito de se obter compostos capazes de atuarem sobre o parasita, desprovidos dos graves efeitos colaterais. Estudos desenvolvidos em nosso laboratório envolvendo lignanas demonstraram uma importante atividade destes compostos sobre as formas tripomastigotas sanguíneas. Assim este estudo tem como objetivo avaliar a atividade terapêutica de derivados de lignana dibenzilbutirolactônicas em sistema in vivo, em fase aguda e crônica da infecção por T. cruzi. Como critérios de estudo avaliamos o comportamento parasitêmico dos animais na fase aguda, quantificamos a enzima -galactosidase nos tecidos do fígado, baço e coração além da análise morfométrica dos tecidos. Com relação à parasitemia, dos animais na fase aguda, as substâncias cubebina e hinoquina, apresentaram significante redução parasitêmica comparado ao controle negativo e melhor atividade no tratamento pela via oral. Na análise por caracterização de -galactosidase, as substâncias apresentaram melhores resultados comparados ao controle positivo (Benzonidazol) e também melhor eficácia da resposta para o tratamento pela via oral. Nos resultados apresentados pela cariometria os grupos de tratamento com as substâncias cubebina e hinoquinina apresentaram valores próximos ao controle não infectado, mostrando que ocorreu uma resposta celular positiva comparado ao controle infectado. / Chagas disease, transmitted by the protozoan Trypanosoma cruzi, affects over 18 million people in Latin America. Even though it was described 100 years ago by Carlos Chagas, it still represents a major public health problem, and there are cases in 18 developing countries located in Central and South America. In Brazil, benznidazole (Rochagan) is the only trypanocidal drug available in the market; however, it has several side effects and limited efficacy in the chronic phase of the infection. In view of the need for new substances with biological activity against T. cruzi, there is growing interest in the search for compounds capable of acting on the parasite, but are devoid of serious side effects. Studies involving lignans developed in our laboratory have shown that these compounds are significantly active against bloodstream trypomastigotes. So this study aims to evaluate the therapeutic activity of derivatives of dibenzylbutyrolactone lignans in vivo, in the acute and chronic infection by T. cruzi. The present study examined the degree of parasitemia in the infected animals during the acute phase of the disease. To this end, the enzyme -galactosidase was measured in the tissues from the liver, spleen, and heart of infected animals, in addition to the morphometric analysis of these tissues. Cubebin and hinokinin led to significant reduction in parasitemia compared to the negative control, and better treatment was accomplished by the oral route. Concerning -galactosidase analysis, cubebin and hinokinin furnished better results compared to the positive control (Benznidazole), the most effective response to treatment being also achieved by oral route. Karyometry also revealed that cubebin and hinokinin were effective, giving values close to those obtained with the uninfected control, thereby showing that there was a positive cellular response.

A doença de Chagas, transmitida pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta mais de 18 milhões de pessoas na América Latina e mesmo tendo sido descrita há 100 anos por Carlos Chagas, esta ainda representa um importante problema de saúde pública, sendo encontrados casos em 18 países em desenvolvimento na América do Sul e Central. No Brasil, o benzonidazol, (ROCHAGAN), é a única droga de atividade tripanocida disponível no mercado mesmo apresentando vários efeitos colaterais e limitada eficácia na fase crônica da infecção. Em vista da necessidade de novas substâncias com atividade biológica sobre T.cruzi, o interesse pela pesquisa vem crescendo com o intuito de se obter compostos capazes de atuarem sobre o parasita, desprovidos dos graves efeitos colaterais. Estudos desenvolvidos em nosso laboratório envolvendo lignanas demonstraram uma importante atividade destes compostos sobre as formas tripomastigotas sanguíneas. Assim este estudo tem como objetivo avaliar a atividade terapêutica de derivados de lignana dibenzilbutirolactônicas em sistema in vivo, em fase aguda e crônica da infecção por T. cruzi. Como critérios de estudo avaliamos o comportamento parasitêmico dos animais na fase aguda, quantificamos a enzima -galactosidase nos tecidos do fígado, baço e coração além da análise morfométrica dos tecidos. Com relação à parasitemia, dos animais na fase aguda, as substâncias cubebina e hinoquina, apresentaram significante redução parasitêmica comparado ao controle negativo e melhor atividade no tratamento pela via oral. Na análise por caracterização de -galactosidase, as substâncias apresentaram melhores resultados comparados ao controle positivo (Benzonidazol) e também melhor eficácia da resposta para o tratamento pela via oral. Nos resultados apresentados pela cariometria os grupos de tratamento com as substâncias cubebina e hinoquinina apresentaram valores próximos ao controle não infectado, mostrando que ocorreu uma resposta celular positiva comparado ao controle infectado. / Chagas disease, transmitted by the protozoan Trypanosoma cruzi, affects over 18 million people in Latin America. Even though it was described 100 years ago by Carlos Chagas, it still represents a major public health problem, and there are cases in 18 developing countries located in Central and South America. In Brazil, benznidazole (Rochagan) is the only trypanocidal drug available in the market; however, it has several side effects and limited efficacy in the chronic phase of the infection. In view of the need for new substances with biological activity against T. cruzi, there is growing interest in the search for compounds capable of acting on the parasite, but are devoid of serious side effects. Studies involving lignans developed in our laboratory have shown that these compounds are significantly active against bloodstream trypomastigotes. So this study aims to evaluate the therapeutic activity of derivatives of dibenzylbutyrolactone lignans in vivo, in the acute and chronic infection by T. cruzi. The present study examined the degree of parasitemia in the infected animals during the acute phase of the disease. To this end, the enzyme -galactosidase was measured in the tissues from the liver, spleen, and heart of infected animals, in addition to the morphometric analysis of these tissues. Cubebin and hinokinin led to significant reduction in parasitemia compared to the negative control, and better treatment was accomplished by the oral route. Concerning -galactosidase analysis, cubebin and hinokinin furnished better results compared to the positive control (Benznidazole), the most effective response to treatment being also achieved by oral route. Karyometry also revealed that cubebin and hinokinin were effective, giving values close to those obtained with the uninfected control, thereby showing that there was a positive cellular response.

Orientador: Rosangela da Silva de Laurentiz / Resumo: Os produtos naturais são uma fonte inesgotável de compostos químicos com as mais variadas propriedades biológicas, entretanto, muitos deles têm baixa biodisponibilidade e/ou são degradados pelas condições fisiológicas, o que os torna de pouco interesse para uso como potenciais fármacos. Dentre os vários produtos naturais bioativos as lignanas apresentam um significativo potencial citotóxico contra várias linhagens de células tumorais, como a (-)-hinoquinina (HNK), (-)-cubebina (CB) e (-)-6,6’-dinitrohinoquinina (DN), determinado em outros trabalhos. Entretanto, essa lignanas possuem caráter hidrofóbico e podem ser degradadas em condições fisiológicas dependendo do pH. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo estudar a incorporação dessas lignanas em nanopartículas poliméricas (NNPs), como forma de melhorar a biodisponibilidade, perdas por degradação e os efeitos da incorporação sobre a atividade citotóxica desses compostos. Neste estudo a HNK e CB foram extraídas da Piper cubeba e a DN foi sintetizada a partir da reação de nitração da HNK. Essa lignanas foram submetidas a ensaios de citotoxicidade contra as linhagens tumorais Hep-2 e Si-Ha. As NNPs com e sem a lignana foram sintetizadas utilizando como matriz polimérica inicialmente o PLGA (Poli(ácido lático-co-ácido glicólico). As NNPs sintetizadas foram caracterizadas quanto ao seu tamanho, morfologia e estabilidade utilizando análises de MEV, DSC, MET, UV/Vis, FTIR, DLS e potencial zeta. A eficiência da incorpora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The natural products are inexhaustible source of chemical compounds with the most varied biological properties; however, many of them have low bioavailability and / or are degraded by physiological conditions, which makes them less interesting for use as potential drugs. Among the several bioactive natural products the lignans present a significant cytotoxic potential against several tumor cell lines, as (-)-hinokinin (HNK), (-)-cubebin (CB) and (-)-6,6’-dinitrohinokinin (DN), determined in previous works. However, these lignans have a hydrophobic character and can be degraded in physiological conditions depending on pH. Thus, the present work aimed to study the incorporation of these lignans into polymeric nanoparticles (PNPs), as a method to improve bioavailability, avoid losses by degradation and evaluate as this incorporation affects the its cytotoxic activity. In this study, the HNK and CB were extracted from Piper cubeba and the DN was synthesized from the nitration reaction of the HNK. These lignans were submitted to cytotoxicity assays against tumoral cells Hep-2 and Si-Ha. The empty and content lignans PLGA (Poly Lactic-co-Glycolic Acid, 65:35) PNPs were synthesized using the emulsion-evaporation methodology on mechanical agitation and dripping. The PNPs were investigated for their size, morphology and stability through SEM, DSC, TEM, UV/Vis, FTIR, DLS and zeta potential. Encapsulation efficiency incorporation of the lignan was determined by analysis of UV/Vis. In th... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Regiane Godoy de Lima (regigodoy@gmail.com) on 2018-07-10T18:42:41Z No. of bitstreams: 1 Tese Regiane versão final.pdf: 4431175 bytes, checksum: ae162e9e86a8dc06ab1e81dc83a8f1cd (MD5) / Approved for entry into archive by Cristina Alexandra de Godoy null (cristina@adm.feis.unesp.br) on 2018-07-10T19:18:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lima_rg_dr_ilha.pdf: 4431175 bytes, checksum: ae162e9e86a8dc06ab1e81dc83a8f1cd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T19:18:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lima_rg_dr_ilha.pdf: 4431175 bytes, checksum: ae162e9e86a8dc06ab1e81dc83a8f1cd (MD5) Previous issue date: 2018-04-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os produtos naturais são uma fonte inesgotável de compostos químicos com as mais variadas propriedades biológicas, entretanto, muitos deles têm baixa biodisponibilidade e/ou são degradados pelas condições fisiológicas, o que os torna de pouco interesse para uso como potenciais fármacos. Dentre os vários produtos naturais bioativos as lignanas apresentam um significativo potencial citotóxico contra várias linhagens de células tumorais, como a (-)-hinoquinina (HNK), (-)-cubebina (CB) e (-)-6,6’-dinitrohinoquinina (DN), determinado em outros trabalhos. Entretanto, essa lignanas possuem caráter hidrofóbico e podem ser degradadas em condições fisiológicas dependendo do pH. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo estudar a incorporação dessas lignanas em nanopartículas poliméricas (NNPs), como forma de melhorar a biodisponibilidade, perdas por degradação e os efeitos da incorporação sobre a atividade citotóxica desses compostos. Neste estudo a HNK e CB foram extraídas da Piper cubeba e a DN foi sintetizada a partir da reação de nitração da HNK. Essa lignanas foram submetidas a ensaios de citotoxicidade contra as linhagens tumorais Hep-2 e Si-Ha. As NNPs com e sem a lignana foram sintetizadas utilizando como matriz polimérica inicialmente o PLGA (Poli(ácido lático-co-ácido glicólico). As NNPs sintetizadas foram caracterizadas quanto ao seu tamanho, morfologia e estabilidade utilizando análises de MEV, DSC, MET, UV/Vis, FTIR, DLS e potencial zeta. A eficiência da incorporação foi determinada através de analises de UV/Vis. Nos ensaios de citotoxicidade todas as lignanas foram ativas, com destaque para a inibição de 98% da HNK sobre a linhagem Hep-2. As três lignanas foram incorporadas em NNPs de PLGA utilizando o método de nanoemulsão-evaporação com agitação mecânica e gotejamento, entretanto a estabilidade dessas NNPs e as porcentagens de incorporação indicaram que apenas as NNPs-PLGA-HNK apresentaram os parâmetros necessários para a utilização nos ensaios de citotoxicidade. Portanto, outros estudos foram realizados com as três lignanas visando a melhora nos métodos de obtenção e estabilidade com o uso de sonicador e diferente composição do PLGA (50:50) e PLGA-PEG. As análises físicas mostraram que as nanopartículas de PLGA (50:50) obtidas através da metodologia por sonicação foram mais estáveis com menores tamanhos e maior potencial zeta em valores absolutos, entretanto, a DN e a CB não foram encapsuladas de forma eficiente. Desta forma, somente a HNK prosseguiu no estudo. O uso do PLGA-PEG alterou de forma significante os parâmetros físicos e químicos das NNPs-PLGA-PEG-HNK em relação as de PLGA-HKN. Os testes de liberação mostraram melhores resultados com as NNPs-PLGA-HNK, principalmente em pH 7,4. O tempo de liberação total da HNK em todas as NNPs avaliadas foi em torno de 30 minutos o que sugere que as nanopartículas obtidas são nanocápsulas. A comparação dos resultados dos ensaios de citotoxicidade mostraram que o CI50 das NNPs de PLGA-HNK foi de 29,8 µM sobre as células tumorais Si-Ha, enquanto a HNK livre apresentou CI50 = 110 µM. Para as outras células tumorais mais agressivas as NNPs de PLGA(50:50)-HNK foram menos eficazes do que a HNK livre, com cerca de 50% de perda da atividade. Esses resultados indicam a efetividade das NPPs de PLGA(65:35)-HNK sobre as células da linhagem Si-Ha, e que o encapsulamento da HNK em NNPs de PLGA pode ser uma alternativa para diminuir a decomposição e aumentar a biodisponibilidade para a condução de em ensaios in vivo. / The natural products are inexhaustible source of chemical compounds with the most varied biological properties; however, many of them have low bioavailability and / or are degraded by physiological conditions, which makes them less interesting for use as potential drugs. Among the several bioactive natural products the lignans present a significant cytotoxic potential against several tumor cell lines, as (-)-hinokinin (HNK), (-)-cubebin (CB) and (-)-6,6’-dinitrohinokinin (DN), determined in previous works. However, these lignans have a hydrophobic character and can be degraded in physiological conditions depending on pH. Thus, the present work aimed to study the incorporation of these lignans into polymeric nanoparticles (PNPs), as a method to improve bioavailability, avoid losses by degradation and evaluate as this incorporation affects the its cytotoxic activity. In this study, the HNK and CB were extracted from Piper cubeba and the DN was synthesized from the nitration reaction of the HNK. These lignans were submitted to cytotoxicity assays against tumoral cells Hep-2 and Si-Ha. The empty and content lignans PLGA (Poly Lactic-co-Glycolic Acid, 65:35) PNPs were synthesized using the emulsion-evaporation methodology on mechanical agitation and dripping. The PNPs were investigated for their size, morphology and stability through SEM, DSC, TEM, UV/Vis, FTIR, DLS and zeta potential. Encapsulation efficiency incorporation of the lignan was determined by analysis of UV/Vis. In the cytotoxicity assays all lignans were active, with emphasis on inhibition of 98% da (-)-hinokinin about the Hep-2 tumoral line. The three lignans were incorporated into PLGA (65:35) NNPs, however the stability of these PNPs and the percentages of incorporation indicated that only the PLGA-HNK PNPs had the parameters required for use in the cytotoxicity assays. Therefore, other studies were performed with the three lignans aiming to improve the methods of obtaining and stability from sonicator and different composition in PLGA: (50:50) and PLGA-PEG. The physical analyzes showed that PLGA (50:50) nanoparticles obtained by sonication were more stable with smaller sizes and higher zeta potential in absolute values. However, even in this method, DN e CB were not efficiently encapsulated. In this way, only HNK continued the study. The use of PLGA-PEG altered the physical and chemical parameters of PLGA-PEG-HNK NNPs obtained when compared to PLGA-HNK NNPs. Release tests showed better results with NNPs-PLGA-HNK, especially at pH 7.4. The total release time of HNK in all NNPs evaluated was around 30 minutes, which suggests that the nanoparticles obtained are nanocapsules. Comparison of cytotoxicity assay results showed that PLGA-HNK PNPs IC50 was 29.8 μM on the Si-Ha tumor cells, while the free HNK showed IC50 = 110 μM. For the other more aggressive tumor cells PLGA (50:50)-HNK PNPs were less effective than free HNK with about 50% loss of activity. These results indicate the effectiveness of PLGA(65:35)-HNK NPPs on cells of the Si-Ha line, and that the encapsulation of HNK in PLGA NNPs may be an alternative to decrease decomposition and increase bioavailability for conducting biological assays in vivo. / PSDE/88881.134923/2016-01