CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A doenÃa de chagas à um grande problema de saÃde pÃblica, afeta cerca de 6 milhÃes de pessoas em todo o mundo e causa altos Ãndices de morbidade e mortalidade nas populaÃÃes afetadas. O benzonidazol (BZ), fÃrmaco utilizado no tratamento apresenta eficÃcia limitada e provoca sÃrios efeitos adversos. O transporte de fÃrmacos por meio de nanopartÃculas tem demonstrado eficiÃncia quanto à liberaÃÃo controlada e direcionada de molÃculas farmacolÃgicas, alÃm de apresentar propriedades desejÃveis, como boa biocompatibilidade e biodegradabilidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a citoxicidade de nanopartÃculas de benzonidazol em carbonato de cÃlcio (BZ@CaCO3) sobre cÃlulas de hospedeiras LLC-MK2; determinar o efeito tripanocida sobre as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas da cepa Y de T. cruzi e comparar ao efeito do BZ, bem como, caracterizar o mecanismo de morte. Os testes de citotoxicidade utilizando o mÃtodo do MTT realizados com cÃlulas LLC-MK2 cultivadas com meio DMEM a 10% de SBF demonstraram IC50 de 55 Âg/mL para BZ@CaCO3 e 160 Âg/mL para BZ. Formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT a 10% de SBF a 28ÂC na presenÃa de BZ@CaCO3 por 24, 48 e 72 horas. BZ@CaCO3 mostrou atividade tripanocida sobre formas epimastigotas nos trÃs tempos de tratamento (CI50 24h = 8,72 Âg/mL; CI50 48h = 8 Âg/mL; CI50 72 h = 4,8 Âg/ml) sendo esse efeito mais significativo que o do BZ (CI50 24h = 56,7 Âg/mL CI50 48h = 15,9 Âg/mL; CI50 72h = 4,3 Âg/ml). Formas tripomastigotas foram obtidas a partir dos sobrenadantes de cÃlulas LLC-MK2 infectadas, ressuspensas em meio DMEM com 2% de SBF e tratadas durante 24 h. As formas tripomastigotas foram mais susceptÃveis a BZ@CaCO3 (IC50 = 1,8 Âg/mL) do que ao BZ (CI50= 67 Âg/mL). Esses ensaios tambÃm foram realizados com nanopartÃculas de carbonato de cÃlcio livres de fÃrmacos (@CaCO3) utilizadas como controle negativo. Nos ensaios com as formas amastigotas obtidas por infecÃÃo de cÃlulas LLC-MK2 BZ@CaCO3 foi capaz de reduzir o % de cÃlulas infectadas, o nÃmero de amastigotas por cÃlulas infectadas e o Ãndice de sobrevivÃncia em 24h de incubaÃÃo. Ensaios de citometria de fluxo utilizando os marcadores de fluorescÃncia 7- amino actinomicina D, anexina V- PE e rodamina 123 mostraram que o efeito tripanocida tanto da BZ@CaCO3 quanto do BZ està relacionado a morte por necrose com alteraÃÃo do potencial mitocondrial. Assim, conclui-se que a BZ@CaCO3 apresenta efeito tripanocida in vitro sobre as trÃs formas de Trypanossoma cruzi, sendo esse efeito potencialmente maior do que o observado para BZ. / A doenÃa de chagas à um grande problema de saÃde pÃblica, afeta cerca de 6 milhÃes de pessoas em todo o mundo e causa altos Ãndices de morbidade e mortalidade nas populaÃÃes afetadas. O benzonidazol (BZ), fÃrmaco utilizado no tratamento apresenta eficÃcia limitada e provoca sÃrios efeitos adversos. O transporte de fÃrmacos por meio de nanopartÃculas tem demonstrado eficiÃncia quanto à liberaÃÃo controlada e direcionada de molÃculas farmacolÃgicas, alÃm de apresentar propriedades desejÃveis, como boa biocompatibilidade e biodegradabilidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a citoxicidade de nanopartÃculas de benzonidazol em carbonato de cÃlcio (BZ@CaCO3) sobre cÃlulas de hospedeiras LLC-MK2; determinar o efeito tripanocida sobre as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas da cepa Y de T. cruzi e comparar ao efeito do BZ, bem como, caracterizar o mecanismo de morte. Os testes de citotoxicidade utilizando o mÃtodo do MTT realizados com cÃlulas LLC-MK2 cultivadas com meio DMEM a 10% de SBF demonstraram IC50 de 55 Âg/mL para BZ@CaCO3 e 160 Âg/mL para BZ. Formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT a 10% de SBF a 28ÂC na presenÃa de BZ@CaCO3 por 24, 48 e 72 horas. BZ@CaCO3 mostrou atividade tripanocida sobre formas epimastigotas nos trÃs tempos de tratamento (CI50 24h = 8,72 Âg/mL; CI50 48h = 8 Âg/mL; CI50 72 h = 4,8 Âg/ml) sendo esse efeito mais significativo que o do BZ (CI50 24h = 56,7 Âg/mL CI50 48h = 15,9 Âg/mL; CI50 72h = 4,3 Âg/ml). Formas tripomastigotas foram obtidas a partir dos sobrenadantes de cÃlulas LLC-MK2 infectadas, ressuspensas em meio DMEM com 2% de SBF e tratadas durante 24 h. As formas tripomastigotas foram mais susceptÃveis a BZ@CaCO3 (IC50 = 1,8 Âg/mL) do que ao BZ (CI50= 67 Âg/mL). Esses ensaios tambÃm foram realizados com nanopartÃculas de carbonato de cÃlcio livres de fÃrmacos (@CaCO3) utilizadas como controle negativo. Nos ensaios com as formas amastigotas obtidas por infecÃÃo de cÃlulas LLC-MK2 BZ@CaCO3 foi capaz de reduzir o % de cÃlulas infectadas, o nÃmero de amastigotas por cÃlulas infectadas e o Ãndice de sobrevivÃncia em 24h de incubaÃÃo. Ensaios de citometria de fluxo utilizando os marcadores de fluorescÃncia 7- amino actinomicina D, anexina V- PE e rodamina 123 mostraram que o efeito tripanocida tanto da BZ@CaCO3 quanto do BZ està relacionado a morte por necrose com alteraÃÃo do potencial mitocondrial. Assim, conclui-se que a BZ@CaCO3 apresenta efeito tripanocida in vitro sobre as trÃs formas de Trypanossoma cruzi, sendo esse efeito potencialmente maior do que o observado para BZ.

El impacto del fuego en el suelo y en los procesos ecológicos que operan en las laderas con matorrales mediterráneos depende de la elevación de temperaturas y de la duración del calor durante el incendio.A pesar de su importancia en nuestros ecosistemas forestales, hay pocos estudios en que se hayan medido de forma experimental, bajo condiciones ambientales típicas del verano, y condiciones controladas de combustible y estado del suelo y de la vegetación.El objetivo de esta tesis es proporcionar datos experimentales de campo y de laboratorio sobre los niveles de intensidad que afectan al suelo como consecuencia de fuegos de verano en dos formaciones de matorral con diferente carga y estructura del combustible, cómo se alteran las propiedades del suelo, cómo se modifica su respuesta a la acción erosiva de la lluvia y cómo se modifican los patrones espaciales y temporales de distribución de la humedad y la temperatura del suelo durante el primer año después del fuego.El área de estudio está localizada en La Concordia a 50 Km al noroeste de la ciudad de València, a una altitud de entre 500 a 575 m. s. n. m., la ladera presenta una pendiente de entre el 30 al 40 % con una orientación sudoeste. El clima es semiárido y la vegetación es de matorral mediterráneo y se distribuye en mosaicos, dominados por las especies de Ulex parviflorus y Rosmarinus officinalis. El tipo de suelo es Leptosol rendzínico (Clasificación FAO) o Lithic Haploxeroll (Clasificación Americana).En la zona de estudio se delimito un área de 114 m de largo por 30 m de ancho. Se seleccionaron 9 parcelas de 20 m x 4 m, equipadas con un colector y depósitos para la recogida de sedimentos y agua de escorrentía. En la parte central del área se instaló una estación meteorológica automatizada. Los incendios experimentales se realizaron el 20 y 21 de junio de 1995, de las 9 parcelas se destinaron 3 para el tratamiento de fuego intenso, otras 3 para el moderado y otras 3 como control (no incendiado). Las temperaturas y duraciones del incendio se registraron mediante termopares conectados a un datalogger. En cada una de las parcelas se tomaron 4 muestras de suelo distribuidas en dos microambientes bajo planta y entre plantas. Asimismo, se instalaron sondas para la medida de la humedad del suelo (por la técnica del TDR) y también se instalaron cápsulas de splash para la determinación de la susceptibilidad del suelo al impacto de las gotas de lluvia.La temperatura máxima y la duración del calor en el suelo aumentan con la cantidad de combustible que se quema y con el grado de compactación de dicho combustible. Un aumento de la carga de combustible de 2 a 4 Kg m-2 hace aumentar la temperatura media máxima de la superficie del suelo de 416ºC a 516ºC y la duración de temperaturas mayores a 100ºC de 20 a 36 minutos. Un aumento de la densidad aparente media del combustible de 2 a 4 Kg m-3 aumenta la temperatura máxima de 446 a 486ºC y la duración de temperaturas >100ºC de 20 a 36 minutos. Para una misma cantidad de combustible, la intensidad es mayor en aquellos espacios de suelo cubiertos por el combustible que tiene menor altura y mayor densidad aparente.Cuando se relacionan las variaciones que experimentan las propiedades del suelo con las intensidades medias obtenidas en función de la carga de combustible, la única propiedad que experimenta una variación estadísticamente significativa respecto del suelo control es el estado de agregación del suelo. Cuando dichas variaciones se analizan teniendo en cuenta las características previas del suelo y la densidad aparente del combustible se obtienen variaciones significativas de la capacidad de retención de agua, la densidad real de las partículas del suelo, la densidad aparente, la estabilidad estructural, la distribución de agregados y el contenido de materia orgánica. Dichas variaciones indican que los efectos en el suelo dependen de las características del suelo previas al incendio, de la cantidad de combustible que se quema y de su grado de compactación.Durante el primer año posterior al incendio, las propiedades más sensibles a la degradación inducida por la intensidad del fuego son la densidad de las partículas del suelo y su estado de agregación. La densidad de las partículas aumenta como consecuencia de la mineralización de la materia orgánica. El porcentaje de macroagregados y su estabilidad disminuyen a lo largo del año. Las pautas estacionales de variación de estas propiedades se alteran respecto a las del suelo no incendiado.La erosionabilidad del suelo, el régimen hídrico y el régimen térmico de cada tipo de superficie se modifican en función de la calidad del suelo antes del fuego y en función de la intensidad de fuego que han recibido. Los suelos de peor calidad (microambiente entre plantas) que han recibido mayor impacto de fuego son más susceptibles a la desagregación por impacto de la gota de lluvia, dan lugar a mayores proporciones de partículas de tamaño pequeño que son más transportables por splash y, dependiendo de la intensidad de lluvia, son también más susceptibles de sufrir una desagregación adicional y un mayor transporte por escorrentía. En el rango de intensidades de lluvia entre 0 y 20 mm h-1 la cantidad de suelo movilizado por splash en cada superficie aumenta linealmente con la intensidad de lluvia y dicho aumento es tanto mayor cuanto mayor es la intensidad de fuego que ha recibido cada una. La intensidad de lluvia que inicia la movilización de suelo por escorrentía es de 5 mm h-1. El tamaño de los sedimentos movilizados por splash es siempre mayor que el tamaño de los sedimentos en el agua de escorrentía. Para intensidades de lluvia entre 5 y 10 mm h-1, la escorrentía arrastra partículas de tamaño arcilla y limo fino, mientras que entre 10 y 20 mm h-1 el tamaño corresponde a limo medio.Respecto a la humedad y temperatura del suelo, los suelos de peor calidad antes del fuego (microambiente entre plantas) que han sufrido mayor intensidad de fuego tienen un balance hídrico y térmico más desfavorable. Dichos suelos tienen mayor contenido de agua, pero se secan más rápidamente, también experimentan mayores variaciones de temperatura y el agua permanece útil para las plantas durante pocos días. Los suelos de mejor calidad antes del fuego (microambiente bajo plantas) que han sufrido el impacto de la intensidad del fuego tienen un balance hídrico y térmico que a lo largo del año de estudio resulta más favorable que el suelo entre plantas. La humedad del suelo tras la lluvia sigue un modelo exponencial decreciente con el número de días transcurridos desde la lluvia. Aunque no se ha realizado un seguimiento del proceso de colonización vegetal, durante el periodo de estudio, la dinámica estacional de la humedad y temperatura del suelo en el área bajo plantas afectado por mayor intensidad, puede resultar más favorable para el inicio del proceso de recuperación vegetal en periodos próximos al invierno, mientras que en las superficies bajo plantas afectadas por menor intensidad, el periodo hídrico y térmico del suelo resulta más favorable es el de la primavera. / The impact of fire on the soil and in ecological processes, which take place on the slopes that have Mediterranean bushes, depends upon the rise of temperature and the duration of heat during the burn.Despite its importance in our forest ecosystems, there are few studies in which experimental measures have been taken under typical summer conditions, controlled fuel and state of the soil, as well as the vegetation, the rise of temperature and its duration in the soil, alterations of the physical properties with regards to the intensity of the fire and the consequences of said alteration in the process of hydric erosion and the function of temperature and humidity of the soil.The aim of this thesis is to provide experimental field and laboratory data on the intensity levels which affect the soil as a consequence of summer fires in two bush formations with different loads and structure of combustion. Discover the changes which take place in: the properties of the soil, the effect of rainfall erosion, changes and effects in spatial and seasonal patchiness of the soil temperature and humidity distribution during the first year after the fire.The soil's structure degrades through alterations in organic or non-organic colloids that form the aggregates of the soil. This degradation, which is in proportion to the increase in fire intensity, modifies the spatial and temporal patchiness variables properties such as the density of the soil, the distribution and stability of the aggregates, a rise in susceptibility of the soil having been displaced through the impact of rainfall and runoff, and altering the spatial and seasonal patchiness humidity and temperature of the soil.

La transcripción es una de las etapas más importantes de la expresión génica. El gen de la gamma-glutamiltranspeptidasa (GGT) de rata posee una estructura y patrón de expresión que posibilitan el estudio de la regulación de la expresión de los genes a nivel de la transcripción. El objetivo de esta Tesis ha sido el estudio de los mecanismos que están implicados en la regulación del promotor I del gen de la GGT de rata a nivel de la transcripción. Con este fin se han llevado a cabo diversos ensayos: detección, purificación y caracterización de factores proteicos nucleares con actividad de unión al promotor I; estudio in vitro de la actividad, expresión y regulación de diferentes zonas del promotor; y estudio de algunos niveles de regulación de la transcripción (efecto de la metilación del ADN, modificaciones post-traduccionales de factores transcripcionales, estructuras de cromatina y efecto de diversos compuestos sobre la actividad del promotor I).Para este gen se ha observado la unión de un complejo multiproteico, presente en extractos hepáticos de rata, a la secuencia de -586 a -566 en la región 5' no traducida del promotor I, constituido por cuatro proteínas con pesos moleculares de 100, 70, 41 y 38 kDa. En dos líneas celulares derivadas de rata se han detectado proteínas con actividad de unión a esta secuencia y con pesos moleculares similares. Estas proteínas se unen al ADN envolviendo a la doble hélice y no parecen ser capaces de modificar estructuras de cromatina. De las cuatro proteínas sólo una (de 70kDa) parece que se fosforila con PK-A en una pequeña fracción y que presenta restos glucídicos de N-acetil-glucosamina. Estos factores nucleares no parecen ser capaces de modificar estructuras de cromatina.Se ha descartado que el factor Sp1 forme parte de este complejo multiproteico a pesar de existir una caja CG degenerada en la secuencia de unión, a la que se une en ensayos in vitro. Por otro lado, en ensayos de transcripción in vitro se ha observado que la transcripción de un promotor deleccionado (fragmento de -765 a -514 adyacente al fragmento de -143 a +144) se debe específicamente a la acción de los factores presentes en los extractos nucleares de hígado de rata. En este promotor deleccionado el acercamiento de la secuencia de unión de los factores en estudio al lugar de inicio de la transcripción, aumenta la especificidad y la eficacia de la transcripción.La metilación del ADN provoca la represión de la transcripción mediada por estos factores nucleares. No se han detectado secuencias posicionadoras de nucleosomas en este promotor.Mediante ensayos de transfección a líneas celulares derivadas de rata se ha observado que diversas zonas de la secuencia que se extiende desde -765 hasta +144, presentan actividad positiva o negativa sobre la expresión de este promotor I: la secuencia que se extiende desde -508 a -143 posee actividad reguladora negativa; el acercamiento de las secuencias presentes en las regiones de -765 a -508 y de -143 a +144 tiene un efecto regulador positivo en la actividad transcripcional del promotor I. Diversas sustancias como la dexametasona y la SAM son capaces de interferir la expresión del gen de la GGT en estas líneas celulares derivadas de rata.Finalmente, análisis informáticos han mostrado la posible relación entre las proteínas en estudio y factores transcripcionales de la familia Egr/Krox.En resumen, en la regulación de la expresión del promotor I del gen de la GGT de rata están implicados tanto elementos cis, como elementos trans, que actuarían de manera coordinada y no aisladamente, regulando la tasa de expresión final del promotor en la célula. / Transcription is one of the most important steps of the gene expression. Rat gamma-glutamyl-transpeptidase (GGT) gene has an structure and expression pattern that facilitates the study of gene expression at transcription level. The aim of this doctoral thesis is the study of the mechanisms that are involved in the regulation of rat GGT promoter I.In our laboratory we have found the binding of trans-factors to a sequence located between -586 and -566 bp, at the 5' untranslated flanking region of the rat GGT promoter I. The molecular weight of these proteins is 100, 70, 41 and 38 kDa and make up a multiprotein complex. In rat derived cell lines we have found proteins that bind the sequence studied and they have with similar molecular weights. We have rule out that Sp1 protein is a part of this protein complex despite of the presence of a degenerate CG box in the binding sequence described. The protein complex binds DNA wrapping the double helix and it cannot introduce changes in chromatin structures. Only one of the four proteins, this 70 kDa one, is phosphorylated for PK-A and it is glycosilated with N-acetyl-glucosamine.On the other hand, we have make a deleted promoter I that is trancribed in vitro by rat liver nuclear extracts, whereas the same sequence but methylated is not. In transfection assays employing rat derived cell lines we have found regions in this promoter I that have positive or negative activity on gene expresion. Substances like dexamethasone and S-Adenosylmethionine are able to disrupt GGT gene expression in these rat derived cell lines.Finally, computer analysis have shown the probable relationship between the proteins analyzed and transcription factors of the Egr/krox subfamily.To sum up, in the transcription regulation of rat GGT promoter I are involved cis- and trans-factors that work coordinatedly, regulating the differential final expression of this promoter in the cell.

Vancomicina es el antibiótico de elección para el tratamiento de infecciones por Sthapylococcus meticilin resistentes (SMR). La elevada prevalencia de infecciones nosocomiales por SMR en las Unidades de Cuidados Intensivos (UCIs), así como la limitada información disponible de los pacientes críticos como grupo poblacional, justifican el estudio de las características farmacocinéticas-farmacodinámicas.OBJETIVO PRINCIPAL Y SECUNDARIOSDesarrollar un modelo farmacoestadístico mediante predicción bayesiana, que permita realizar el ajuste posológico individualizado de VCM en pacientes críticosLos objetivos secundarios han sido: establecer el modelo farmacocinético que mejor describa el comportamiento de los pares de valores concentración plasmática-tiempo de VCM en la población de pacientes críticos. validar las concentraciones plasmáticas proporcionadas por cada uno de los modelos farmacoestadísticos desarrollados. analizar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos en relación al resultado clínico en los pacientes.PACIENTESEl estudio responde a un diseño de cohortes retrospectivo llevado a cabo en el Servicio de Cuidados Intensivos del Hospital Universitario Dr Peset (Valencia). La población se subdividió en dos grupos: la población A constituida por 30 pacientes y de 234 pares de valores concentración plasmática (Cp)-tiempo que permitieron la selección del modelo farmacocinético y el análisis farmacocinético y farmacodinámico y la población B constituida por 20 pacientes y 103 Cp permitieron la validación de los parámetros estimados en la etapa previa. MÉTODOEl análisis farmacocinético incluye :1. Selección del modelo farmacoestadístico, ajustando los pares de valores Cp-tiempo al modelo mono y bicompartimental y cuantificando la magnitud y dispersión de los residuales.2. Estimación de los parámetros de tendencia central y variabilidad mediante tres métodos: método estándar en dos etapas, no paramétrico y no lineal de efectos mixtos.3. Validación de los parámetros farmacocinéticos obtenidos mediante predicción bayesiana.El análisis farmacodinámico evaluó la relación de la leucocitosis, la duración de la estancia en UCI y el resultado del paciente (alta vs exitus) con los marcadores diferidos: AUIC y T>CMI parámetros que cuantifican la exposición de los microorganismos a VCM.RESULTADOS Y CONCLUSIONES1. El modelo que mejor ajusta los pares de valores Cp-tiempo fue el modelo bicompartimental abierto con perfusión IV intermitente.2. En la población de pacientes críticos la fracción correspondiente al aclaramiento no renal (Clnr) se sitúan entre 17 y 24 mL/min..3. La introducción del aclaramiento de creatinina en el modelo farmacoestadístico reduce la variabilidad interindividual del aclaramiento de VCM del 53% al 29%. La introducción del PCT reduce la variabilidad de Vc de 55% al 36% y de Vp de 114% al 40%.4. Mantener la concentración plasmática por encima de la 10mg/L garantiza una recuperación más temprana de la leucocitosis (mediana de 8.5 vs 13.6 días).5. Mantener un AUIC de 300 garantiza una recuperación más temprana de la leucocitosis (15 vs 11 días). / To estimate population pharmacokinetic parameters of vancomycin and to develop a bayesian forecasting method to individualise vancomycin dosage regimens in critically ill patients.Patients and Methods:50 patients with suspected or confirmed infection due to vancomycin sensitive micro-organisms were included. 234 plasma concentration-time data sets from 30 patients obtained during routine drug monitoring were used to estimate the pharmacokinetic parameters. To validate the different models data sets from 20 different patients from the same population of critically ill patients were used.Pharmacokinetic analysis:The two compartment open linear model with intermittent intravenous perfusion was used to fit data sets. Parameterisation used was: volume of the central compartment (Vc), non-renal clearance (Clnr), renal clearance as a linear relationship with creatinine clearance (p) and intercompartment distribution constants (K12 , K21).Pharmacokinetic parameter values were estimated by three different methods implemented in different software: the nonparametric maximum expectation algorithm (NPEM2-USC*PACK) and two parametric methods: non-linear regression model (PKS and WinNonlin) and nonlinear mixed-effects modelling (NONMEM).A pharmacodynamic analysis of AUIC (area under the inhibitory serum concentration-time curve) and T>CMI (time that the serum concentrations of a given agent exceeds the CMI) was performed.To verify the predictive value of the models for new individuals, two different forecast strategies were assessed: (a) no feedback prediction of Cmax and Cmin and (b) feed-back prediction of Cmax using population parameters plus a sole value of plasma concentration (Cmin). RESULTSNon-renal clearance estimated with NPEM2 and NONMEM was higher than those previously reported, Clnr 0.34 (0.31) and 0.25 (0.20) mL/min/kg respectively, that is about 30% of total vancomycin clearance. Volume of the central compartment estimated duplicated that previously reported 0.51 (0.26) and 0.41 (0.03) L/kg.As pharmacodynamics is related, achieving an AUIC24 equal or higher than 300 or keeping plasma concentrations above 10mg/L for more than 90% of the time, provides a shorter recovery of leukocyte count.Differences in performance were significant by the use of the method of prediction. Non linear regression models provided biased estimates of the predictions. Parameters that best fitted plasma concentrations were those obtained with the non-linear mixed-effects modelling.

El acamprosato o bis-acetilhomoaurinato cálcico es un fármaco que se emplea en la terapia de mantenimiento de la abstinencia en pacientes dependientes del alcohol. Sin embargo, uno de los problemas más importantes en su manejo clínico deriva de su reducida biodisponibilidad oral en magnitud (BD), que se sitúa en torno a un 11% en humanos. Por ello, mediante el empleo de diversos y sencillos diseños experimentales se ha abordado el estudio de dos de los procesos menos conocidos de su farmacocinética, la absorción y la eliminación. El estudio de la linealidad farmacocinética del acamprosato se ha realizado tras la administración intravenosa rápida de 2.8, 11 ó 22 mg del fármaco, así como tras su perfusión endovenosa a 2.6, 132.5 ó 530.0 µg/min. La comparación de los principales parámetros farmacocinéticos obtenidos, no reveló ninguna diferencia estadísticamente significativa entre ellos. Por tanto, a tenor de los resultados obtenidos parece ser que el acamprosato presenta una disposición lineal en el ámbito de concentraciones estudiadas, tanto en condiciones de estado estacionario como tras su administración intravenosa rápida. En lo relativo a su eliminación, nuestros resultados indican claramente que el acamprosato se elimina inalterado por vía renal casi en exclusividad ( = 95.0 ± 13.9%). Los elevados valores de aclaramiento total estimados tras la administración intravenosa rápida de diferentes dosis de acamprosato, así como los de aclaramiento total y renal calculados en estado estacionario, sugieren que la filtración glomerular no es el único mecanismo de excreción renal implicado en su eliminación. Con el objetivo de confirmar la existencia de un proceso de secreción tubular activa paralelo a la filtración glomerular, que podría ser responsable de los elevados valores de aclaramiento del fármaco, se administró conjuntamente el acamprosato con probenecid, conocido inhibidor de la secreción tubular activa. Los niveles plasmáticos promedio del fármaco en los animales tratados con probenecid (10 ó 20 mg) fueron claramente superiores a los obtenidos en el grupo control, obteniéndose un incremento significativo (p<0.001) en sus valores de . Es decir, a la luz de todas nuestras experiencias el acamprosato se elimina inalterado a través de la orina de los animales tratados utilizando dos mecanismos: la filtración glomerular y la secreción tubular activa. La BD del acamprosato en la rata, se determinó tras la administraron de 2.8 ó 22 mg de acamprosato por vía oral, obteniéndose un valor de disponibilidad biológica que se situó en torno al 20%. Paralelamente, la comparación estadística de los valores de semivida de eliminación del acamprosato obtenidos tras su administración intravenosa rápida y oral mostró la existencia de diferencias estadísticamente significatvas (p<0.001) entre ellos. Estos resultados demuestran la existencia de un comportamiento Flip-Flop en la farmacocinética del acamprosato tras su administración por vía oral. La perfusión in situ de una solución de 560 µg/ml de acamprosato en los diferentes tramos en los que se dividió el intestino delgado de la rata (proximal, medio ó distal) demostró que los valores de ka del fármaco no varían a lo largo del intestino delgado de la rata, siendo su baja permeabilidad intestinal (ka= 0.36 ± 0.12 h-1) la principal causa de su reducida BD. Finalmente, se trató de incrementar su BD mediante el empleo de distintos promotores de la absorción intestinal. A través de diversas metodologías, in vitro, in situ e in vivo, se ha podido establecer que la absorción intestinal del acamprosato se produce mayoritariamente por difusión pasiva a través de la ruta paracelular en el intestino delgado de la rata. Los estudios in situ e in vitro indicaron que el caprato sódico (13 ó 16 mM) es capaz de incrementar la permeabilidad intestinal del acamprosato. Sin embargo, los resultados de los estudios realizados in vivo no mostraron incrementos significativos en los valores de biodisponibilidad en magnitud del fármaco en presencia, incluso, de elevadas concentraciones (50 mM) de este promotor. / Acamprosate is a drug used in relapse prevention of alcoholism. The purpose of the present study was to investigate the mechanisms involved in the absorption and elimination of this drug in the rat. In order to study the linearity of acamprosate disposition, rats received 2.8, 11 or 22 mg of the drug as an intravenous bolus. Moreover, acamprosate was perfused by the intravenous route at three different constant infusion rates (2.65, 132.5 and 530.0 µg/min). The statistical analysis of the pharmacokinetic parameters did not reveal any significant difference, indicating that acamprosate disposition was linear within the range of the doses assayed. Relating to its elimination, the obtained results indicated that the administered dose was excreted unchanged and exclusively by renal route( = 95.0 ± 13.9%). Moreover, values were clearly higher than the glomerular filtration rate, suggesting the existence of a highly efficient tubular secretion mechanism in the renal excretion of the drug. To confirm this hypothesis, two groups of rats were intravenously treated with probenecid (10 or 20 mg) prior to acamprosate administration. Probenecid provoked a statistically significant (p<0.001) dose-dependent increase in mean plasma levels of acamprosate, demonstrating the existence of a tubular secretion process on the renal excretion of acamprosate in the rat.The acamprosate bioavailability in rats, estimated after the oral administration of 2.8 or 22 mg of the drug, was around 20 %. The statistical analysis reveal the existence of differences among the values estimated after oral and intravenous administration.This fact suggests the existence of a flip-flop phenomenon involved in acamprosate pharmacokinetics after oral administration. We perfused an isotonic solution of acamprosate (560 µg/ml) in the proximal, middle or distal segment of the small intestine of the animals. The topographic study of acamprosate absorption in the rat revealed non-significant differences among values tested. So, there is not a preferent zone in the acamprosate intestinal absorption in the rat and, probably, this low value is responsible for the low bioavailability of the drug after oral administration. Finally, we made an attempt to improve acamprosate bioavailability through the modulation of its intestinal absorption with several enhancers using in situ, in vitro and in vivo models. Only sodium caprate (C10) was able to increase the of acamprosate and the apparent permeability ( ) obtained in Caco-2 cells (around 2-fold). However, the drug bioavailability in rats (around 20%) did not improve in presence of any of the C10 concentration tested. It is concluded that acamprosate absorption occurs likely via paracellular pathway and can be enhanced by sodium caprate in situ and in vitro but not in vivo

Este estudio caracteriza los mecanismos de control de la secreción ácida gástrica en el ratón, in vivo, en diferentes condiciones experimentales, incluyendo el empleo tanto de animales normales como de animales con potenciales alteraciones en la función gástrica y sus mecanismos de control, como es el caso de la irritación química con yodoacetamida o la manipulación genética dirigida a interferir factores directamente implicados en la regulación de la función gástrica, en este caso el receptor de tipo 2 de la somatostatina (SSTR2).El primer modelo empleado se basa en la inducción de una gastritis mediante la administración oral del irritante químico yodoacetamida durante 6 días. Los estudios morfológicos realizados muestran que el tratamiento con yodoacetamida induce una gastritis leve caracterizada por la presencia de un infiltrado inflamatorio difuso, con un incremento en el número de mastocitos en la submucosa, y la ausencia de lesiones aparentes, macro o microscópicas, en la mucosa. Durante la gastritis, se alteran los mecanismos de control de la secreción ácida gástrica, lo que resulta en una elevada tasa de secreción basal y una respuesta hipersecretora a los secretagogos gastrina e histamina, sin afectarse significativamente la tasa de vaciamiento gástrico. Mediadores de origen mastocitario incrementan la respuesta secretora, tal y como sugieren los experimentos con cromoglicato sódico; mientras que las prostaglandinas tienden a compensar estados de hipersecreción minimizando la exposición de la mucosa al ácido, contribuyendo a mantener su integridad. El segundo modelo empleado se basa en el uso de animales modificados geneticamente, carentes del receptor SSTR2 (SSTR2 -/-). Los resultados obtenidos muestran que estos animales son aparentemente normales en cuanto a su morfología gástrica, abundancia relativa de células con inmunoreactividad de tipo gastrina y somatostatina en la mucosa, respuesta secretora al alimento y vaciamiento gástrico. Sin embargo, durante la anestesia con uretano se pone de manifiesto la falta del receptor SSTR2, resultando en una secreción ácida gástrica basal entre 10 y 15 veces superior en los animales SSTR2 -/- con respecto a los animales no manipulados genéticamente. Esta elevada secreción basal es totalmente dependiente de las vías gastrina-histamina. El uso combinado de ratones SSTR2 -/-, la inmunoneutralización in vivo de la gastrina y la somatostatina endógenas y la manipulación farmacológica de los receptores de somatostatina (SSTR1-5) con agonistas selectivos y con el antagonista SSTR2, PRL-2903, ha permitido demostrar que en el ratón, al igual que en otras especies, los efectos periféricos de la somatostatina sobre la secreción ácida gástrica están mediados en su totalidad por receptores SSTR2. La actividad antisecretora de la somatostatina frente a los secretagogos pentagastrina e histamina y la presencia de receptores SSTR2 en células parietales y de tipo enterocromafin (ECL) hace plausible la hipótesis de que la somatostatina regule la secreción ácida gástrica a través de un mecanismo paracrino que implica la inhibición de la liberación de histamina de ECL y, en menor medida, un efecto inhibitorio directo sobre las células parietales.Finalmente, se han caracterizado los efectos sobre la secreción ácida gástrica de los neuropéptidos bombesina y PACAP. Los resultados obtenidos muestran que ambos actúan periféricamente inhibiendo la secreción ácida gástrica, sin que haya evidencias de que medien respuestas estimulantes. El uso combinado de animales carentes del receptor SSTR2, la inmunoneutralización in vivo de la somatostatina endógena y el bloqueo farmacológico de los receptores SSTR2 demuestra que los efectos antisecretores de la bombesina y del PACAP están mediados a través de la liberación de somatostatina y la consiguiente activación de receptores SSTR2. Estos resultados, junto a observacionesp revias con otros neuropéptidos inhibitorios, sugieren que la vía somatostatina-receptores SSTR2 puede ser un mecanismo común para generar respuestas secretoras inhibitorias en el estómago. / This study characterizes the regulatory mechanisms of gastric acid secretion in mice, in vivo, in different experimental conditions. First, we characterized pathophysiological alterations linked to gastritis of non infectious origin, induced by exposure of the gastric mucosa to the chemical irritant iodoacetamide. Secondly, we studied the role of somatostatin receptors (SSTR1-5), with special emphasis on SSTR2 receptors, on the regulation of gastric acid secretion and the secretory effects of the neuropeptides bombesin and PACAP.In mice, orally administered iodoacetamide induces a mild gastritis characterised by a moderate inflammatory infiltrate, with an increase in the number of mast cells in the submucosa, without any evidence of macro or microscopic damage. However, basal gastric acid secretion and secretory responses to secretagogues were increased during gastritis. Changes in basal secretion might be related to alterations in the feedback control mechanisms between gastrin and somatostatin, as suggested for other inflammatory models. Enhanced secretory responses to secretagogues (pentagastrin and histamine) were blocked by the mast cells stabilizer, sodium cromoglycate, suggesting a mast cells contribution in these hipersecretory responses. On the other hand, pretreatment with indomethacin further enhanced the secretory responses to pentagastrin and histamine suggesting a prostaglandin-dependent counteracting mechanism that might act reducing hypersecretory responses to minimize acid production and exposure of the gastric mucosa.The use of genetically modified mice (knockout for the gene encoding for SSTR2 receptors) together with the immunoneutralization of endogenous somatostatin and the pharmacological manipulation of somatostatin receptors, using selective agonists and antagonists, clearly demonstrates that the antisecretory effects of somatostatin are mediated through SSTR2 receptors. Moreover, similar experimental approach served to demonstrate that the antisecretory effects of the neuropeptides bombesin and PACAP depend upon the release of somatostatin and the activation of SSTR2 receptors. These observations, together with previous studies characterizing the mechanism of action of several inhibitory mediators, suggests that gastric D cells may function as a common target for a variety of inhibitory peptides, which input will be translated into the release of somatostatin and the activation of SSTR2 receptors, leading to an inhibition of acid output.

Las hidrofobinas son una familia de proteínas fúngicas hidrofóbicas de secreción, de pequeño tamaño molecular, que exhiben capacidad para autoensamblarse y para unirse a una interfase hidrofílica/hidrofóbica formando una película anfipática (Wessels, 1997). Son proteínas que se dan exclusivamente en hongos miceliares, se caracterizan por presentar ocho residuos de cisteína conservados en sus secuencias (Wessels, 1994, 1997) que forman puentes disulfuro intramoleculares (De Vries et al., 1993), y están implicadas en la formación de estructuras aéreas y en la unión de las hifas a estructuras hidrofóbicas formando agregados. Estas proteínas poseen gran importancia en los pasos iniciales de la patogénesis fúngica y también son fuentes potenciales para su uso en aplicaciones biomédicas (Wessels, 1997).En este trabajo se describe por primera vez en el hongo dimórfico, patógeno oportunista, Candida albicans, la caracterización de una especie perteneciente a esta familia de proteínas. Mediante el inmunorrastreo de una genoteca de expresión con un anticuerpo policlonal específico de la forma micelial de C. albicans (mPAb), se ha aislado, clonado y caracterizado un nuevo gen de este hongo, al que se ha denominado CaHPB. Dicho gen contiene un posible marco abierto de lectura que codifica para una proteína de 250 aminoácidos (CaHpbp) con un peso molecular de 25.173 Da. El análisis informático de la secuencia reveló la existencia de una región de unos 115 aminoácidos que contiene ocho restos de cisteína localizados en posiciones altamente conservadas, así como de un péptido señal de secreción y de un posible motivo tipo GPI, características compartidas con otras proteínas de la pared celular de C. albicans parcialmente caracterizadas como son Rbt5p y Csa1p/Wap1p.Los ensayos de inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal monoespecífico generado frente a un dominio inmunogénico de la proteína CaHpbp (PAb anti-CaHpbp) reveló que esta molécula se encontraba presente en la superficie celular de C. albicans, mayoritariamente en la forma micelial del hongo.El análisis mediante inmunotransferencia de diferentes extractos obtenidos tanto de paredes celulares aisladas como de células intactas, utilizando el PAb anti-CaHpbp como sonda, indicó que la proteína CaHpbp es secretada al medio extracelular, encontrándose asociada a la superficie de las células del hongo mediante interacciones de tipo no covalente. El marcaje con cisteína radiactiva permitió cuantificar la eficacia de diferentes agentes para solubilizar la especie CaHpbp, encontrándose que el SDS al 1% a pH 9 y el etanol al 60% eran los tratamientos que tenían mayor capacidad de extracción.La especie CaHpbp mostró capacidad para interaccionar con micelas de aceite en una interfase hidrofílica/hidrofóbica de agua y aceite, formando en la superficie de las mismas una capa detectable mediante inmunofluorescencia con el PAb anti-CaHpbp, que podría representar una membrana anfipática. La molécula CaHpbp presente en el medio de cultivo también exhibió la propiedad de adsorberse a la superficie de microesferas de vidrio. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que la especie CaHpbp se trata de una hidrofobina de clase II, moléculas de secreción que hasta el momento no se han identificado en C. albicans, aunque sí en otras especies de hongos patógenos. CaHpbp se expresa in vivo, como se deduce de los resultados de la detección inmunohistoquímica en los cuales, se observa la expresión de esta molécula en células de C. albicans presentes en muestras de tejidos obtenidas por necropsia y biopsia de pacientes con candidiasis sistémica y/o superficial. Estas observaciones sugieren que la especie CaHpbp podría tener un papel como factor de virulencia en este hongo. / In this work, we have cloned and characterized a class II hydrophobin-like molecule in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans, which exhibits all the characteristics previously described for this type of secretory proteins in other fungal species. Hydrophobins are a small secreted fungal proteins that self-assemble at hydrophilic/hydrophobic interfaces into amphipathic films thereby changing the nature of surfaces (i.e., hydrophobic surfaces become hydrophilic, while hydrophilic surfaces become hydrophobic) and are among the most surface-active biosurfactants known. This attribute can be used to introduce hydrophobic foci on the surface of hydrophilic supports where hydrophobins are attached by covalent binding in response to the environment. Hydrophobins are characterized by the presence of eight conserved cysteine residues that from four disulphide bridges and by a typical hidropathy pattern. Hydrophobins have been classified into two classes, class I and class II hydrophobins. Apart from eight conserved cysteine residues, the amino acid sequences between and within both classes have diverged considerably, and this is reflected in the biophysical properties of these proteins. For instance, assemblages of class I hydrophobins are highly insoluble and only can be dissolved by treatment with formic acid or trifluoroacetic acid, while those of class II hydrophobins only can be dissolved by SDS or ethanol. The properties of hydrophobins make them interesting candidates for use in a wide range of medical and technical applications. Each application has its own requirements, which may be met by using specific natural variants of hydropnobins or by modifying hydrophobins chemically or genetically. Applications also require high production systems for hydrophobins. In this respect, filamentous fungi that naturally secrete hydrophobins into the medium seem to be the hosts of choice. They have been shown to be important in many morphogenetic processes, including sporulation, fruit body development, and infection structure formation. The characterization for the first time of a molecule of this nature in C. albicans may open new therapeutic and diagnostic approaches for the management of candidiasis, since hydrophobins most likely may be related with virulence (allowing the fungal cells to interact better with host tissues during infection) and these kind of fungal moieties are not synthesized by animal cells.

El interés analítico que la quimioluminiscencia en fase líquida ha despertado en las dos ultimas décadas y la falta de predicciones teóricas seguras sobre si un sistema va o no a tener un comportamiento quimioluminiscente, hace necesario la búsqueda de nuevos métodos o estrategias que sean capaces de predecir esta actividad. En la presente tesis doctoral se aplica un método de predicción teórico basado en la topología molecular, como la conectividad molecular, para predecir el comportamiento quimioluminiscente de un grupo de fenoles y polifenoles cuando reaccionan con oxidantes fuertes en fase líquida.La validez de las predicciones teóricas se complementa con un barrido experimental en un sistema en flujo continuo con diversos oxidantes, para estudiar la posibilidad de obtener una señal quimioluminiscente a partir del producto de una reacción de oxidación. Tras una etapa de revisión bibliográfica de entre los compuestos ensayados, se seleccionan el fenol, ácido tánico y la hidroquinona, con el objeto de desarrollar nuevos sistemas por quimioluminiscencia directa para su determinación, empleando métodos de análisis en flujo, como el FIA y la Multiconmutación, que permite miniaturizar los montajes en flujo, mejorar la reproducibilidad, diminuir el consumo de muestras y reactivos, además de conseguir sistemas en flujo mucho más versátiles, debido al mayor control de los perfiles de dispersión.La aplicación analítica de los métodos descritos en esta memoria se centra en la determinación de ácido tánico e hidroquinona en formulaciones farmacéuticas y del fenol en muestras de interés medioambiental, como el agua, ya que las disposiciones legales en cuanto a la calidad de los productos farmacéuticos y de las aguas son cada vez más estrictas.Destacar que en el montaje para la determinación de fenol en agua, se incorpora un reactor en fase sólida relleno con resina Amberlite XAD-4 para la separación-preconcentración del analito, lo que permite mejorar la sensibilidad, la selectividad y el límite de detección del método propuesto.Los métodos quimioluminiscentes desarrollados en la memoria emplean permanganato potásico en medio ácido sulfúrico o perclórico como oxidante para la obtención de la señal quimioluminiscente. Esta quimioluminiscencia se exalta con diferentes agentes químicos y/o físicos, concretamente ácido fórmico y una temperatura de 80ºC en la determinación de fenol; sulfato de quinina y una temperatura de 60ºC en el ácido tánico; sulfato de quinina, el tensoactivo catiónico cloruro de benzalconio y una temperatura de 60ºC para la determinación de hidroquinona.Las características analíticas de las determinaciones de fenol, ácido tánico e hidroquinona fueron, respectivamente y por este orden: repetitividad 7.30 %, 2.10 %, 1.98 %; frecuencia de inserción 4, 56, 103 muestras por hora; intervalo de linealidad comprendido entre 1.0 y 20.0 ppb, 0.5-20.0 ppm, 0.1 y 15.0 ppm; límite de detección de 1.0 ppb, 100.0 ppb, 30.0 ppb; reproducibilidad entre días 9.50 %, 4.40 %, 2.88 %; y robustez química 4.6 % y 4.3 % para el ácido tánico y la hidroquinona.Para finalizar, comentar que los tres métodos analíticos se aplican satisfactoriamente al análisis de distintas muestras reales, debido a la gran selectividad de los mismos, que queda confirmada con la elevada cantidad de sustancias ensayadas que no interfieren en la determinación de los analitos.

El presente trabajo constituye una aplicación de la topología molecular, que tiene por objetivo la obtención de nuevos compuestos con actividad antibacteriana aplicando un modelo basado en redes neuronales artificiales combinado con análisis lineal discriminante, para realizar la selección molecular, empleando como descriptores un conjunto de Índices Topológico-Estructurales desarrollados en nuestra unidad de investigación, caracterizados por ser números enteros sencillos y cumplir una de las características fundamentales de los índices topológicos que es la de ser invariantes de grafo.En primer lugar se eligió el grupo farmacológico sobre el que trabajaremos que en nuestro caso fueron los antibacterianos. El interés por dicho grupo terapéutico se basa fundamentalmente en su gran importancia clínica, unido a la creciente aparición de resistencias a los antibióticos habitualmente empleados, lo que hace necesaria la búsqueda de nuevas estructuras químicas que posean dicha propiedad farmacológica.Una vez elegido el grupo terapéutico el siguiente paso es seleccionar las moléculas que van a constituir los grupos de discriminación, es decir, activos e inactivos. Las moléculas pertenecientes a ambos grupos fueron obtenidas de la base de datos de la decimosegunda edición en CD-Rom del Merck Index.El grupo de activos está compuesto por 217 antibacterianos pertenecientes a distintos grupos químicos como son aminoglicósidos, anfenicoles, ansamicinas, &#946;-lactámicos, lincosamidas, macrólidos, polipéptidos, tetraciclinas, nitrofuranos, quinolonas, sulfonamidas, sulfonas y otros. El grupo de inactivos está compuesto por 216 moléculas pertenecientes a distintas categorías terapéuticas como son analgésicos narcóticos, analgésicos no-narcóticos, antidepresivos, antihistamínicos, hipolipemiantes, antihipertensivos, hipoglucemiantes y sedantes e hipnóticos. Tanto en el grupo de activos como en el de inactivos se realiza una división estableciendo grupos de aprendizaje o entrenamiento y de test compuestos por el 70 % y el 30 % de moléculas respectivamente. A partir de la descripción en formato SMILES de las moléculas obtenemos una estructura de datos en forma de grafo, que mediante algoritmos de recorrido en profundidad y recorrido en anchura nos permiten calcular sus correspondientes índices topológico-estructurales, que nos proporcionan información sobre el número y tipo de átomos, número y tipo de enlaces, valencia topológica y distancias entre pares de átomos de la molécula. El siguiente paso es el procesado de estos índices mediante la red neuronal artificial, que tras un proceso de entrenamiento determinaremos cuáles serán las características más idóneas de la misma para realizar un adecuado proceso de discriminación. De forma paralela al procesado de índices mediante la red neuronal artificial, se realiza un análisis lineal discriminante, tras el cual obtendremos una función discriminante, que permita realizar la clasificación de los compuestos en activos e inactivos.Posteriormente mediante la función discriminante obtenida realizaremos una búsqueda guiada de estructuras con teórica actividad antibacteriana, que cumplan los requisitos topológicos marcados por dicha función, de entre los compuestos de la base de datos del módulo CS ChemFinder 5.1, perteneciente al paquete CS ChemOffice, una de las herramientas más útiles en el sector de la química computacional. La base de datos contiene catálogos de moléculas de distintos laboratorios como son Sigma-Aldrich, Fluka, Fisher, Avocado, etc.Una vez seleccionados distintos compuestos mediante la búsqueda guiada anteriormente citada, debemos calcular los índices topológico-estructurales de los mismos y posteriormente se procede a procesar estas moléculas, introduciéndolas en la red neuronal artificial entrenada, obteniendo una clasificación de estos compuestos en activos e inactivos.Los compuestos que mostraron teórica actividad antibacteriana fueron sometidos en primer lugar a ensayos de susceptibilidad antimicrobiana frente a cuatro cepas de microorganismos de referencia, dos gram-negativos y dos gram-positivos, para poner de manifiesto su actividad y la capacidad predictiva del método propuesto. Posteriormente los compuestos que se mostraron activos en estos ensayos fueron sometidos a ensayos de toxicidad aguda en animales de experimentación con objeto de determinar la Dosis Letal 50 de los mismos. De los compuestos seleccionados como teóricos antibacterianos, cuatro de ellos confirmaron dicha actividad, el compuesto N-[4-(2-Benzoxazolil)fenil]maleimida mostró actividad simultáneamente frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis, obteniendo valores de CMI que mejoran claramente los que presentan Cefalosporina C y Ácido nalidíxico, empleados como fármacos de referencia; el compuesto 1,1'-(Metilene-di-4,1-fenilen)bismaleimida lo hizo frente a Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis; el producto o-Cresolftaleina complexona se mostró activo frente a Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa; mientras que el compuesto Dianhidrido etilendiaminotetraacético presentó actividad frente a Escherichia coli y Enterococcus faecalis. La determinación de la DL50 intraperitoneal en ratón para los cuatro productos que mostraron actividad antibacteriana, ha puesto de manifiesto la escasa toxicidad de los mismos, obteniéndose márgenes terapéuticos de considerable amplitud para dos de ellos, pues el compuesto N-[4-(2-Benzoxazolil)fenil]maleimida presenta valores de DL50 entre diez y veinte veces superior a los de CMI obtenidos frente a Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus; mientras que el compuesto 1,1'-(Metilene-di-4,1-fenilen)bismaleimida posee valores de DL50 entre tres y seis veces superiores a sus valores de CMI frente a Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus.Los resultados obtenidos confirman plenamente la validez del método topológico empleado, en la búsqueda y selección de nuevas estructuras con actividad antibacteriana, tanto por la idoneidad de los índices topológico-estructurales como por la utilización combinada de análisis lineal discriminante y redes neuronales artificiales. / In this work we use an interesting approach to QSAR analysis, namely the use of a set of Topological Indices as simple integers applied to individual atoms and bonds in molecules. The important common feature of all those descriptors is the independence of their numerical values on renumbering atoms in a chemical structure. These descriptors encode information about atom type, bonds, degree vertex, distances between pairs of atoms, etc. and so constitute an alternative to the use of molecular descriptors in QSAR studies, not only for the calculation process but also for a simpler interpretation in the prediction of the biological properties for a homogeneous collection of chemicals, so that such models are generally applicable.Finding structure-activity relationships is essentially a pattern recognition process, and historically, QSAR models have been developed using linear methods such as Linear Discriminant Analysis, however, several nonlinear QSAR methods have been proposed in recent years. Artificial Neural Networks is one group of methods that are increasingly being used in drug design to QSAR studies. This method is capable of recognize highly nonlinear structure-activity relationships, in contrast, LDA approaches can capture only linear relationships between molecular characteristics and structural or functional features to be predicted.The aim of this work was to discriminate between antibacterial and non-antibacterial compounds by topological methods and demonstrate the discriminative ability of the group of simple topological descriptors above mentioned in order to select new antibacterial agents from among new structures. For this purpose, the methods used for antibacterial activity discrimination were linear discriminant analysis and artificial neural networks. In the current study a total of 217 molecules with well-known antibacterial activity and 216 compounds without this activity were used.Finally, pharmacological and toxicological tests were carried out to determine the antibacterial activity and toxicity respectively of the compounds selected.

La tesis doctoral presentada tiene como objetivo general la síntesis y caracterización de complejos metálicos de Mn(II), Mn(III) y Cu(II) con sulfonamidas N-derivadas. Además del estudio químico de caracterización de los complejos obtenidos, se ha analizado su actividad biológica cuando actúan como agentes miméticos del enzima natural superóxido dismutasa y como nucleasas químicas. Los ligandos utilizados para las síntesis de los diferentes complejos han sido: 4-amino-N-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)bencenosulfonamida (sulfametizol; Hsmtz), 4-amino-N-(4,6-dimetil-2-pirimidinil)bencenosulfonamida (sulfametazina; Hsmtzn),N-(tiazol-2-il)toluenosulfonamida (Htz-tol), N-(tiazol-2-il)bencenosulfonamida (Htz-ben) y N-(tiazol-2-il)naftalenosulfonamida (Htz-naf). Los dos primeros han sido adquiridos comercialmente, mientras que los últimos han sido sintetizados por primera vez para la realización de este trabajo. La caracterización de estos ligandos se ha realizado a través de las técnicas de análisis elemental, espectroscopía infrarroja y mediante difracción de rayos-X. Con estas sulfonamidas se han obtenido complejos binarios y ternarios de Mn(II), Mn(III) y Cu(II), con piridina o imidazol y derivados. Los complejos obtenidos han sido: Mn(smtz)2(py)2·4H2O Mn(smtz)2(imH)2·H2O Mn(smtz)2(N-metilimH)2·3H2O[Mn(4-metilimH)2(OH2)4](smtz)2 Mn(smtzn)2·3H2O &#61563;[Mn(smtzn)2(OH2)]·(imH)&#61565;n Mn(smtzn)3·3H2O [Cu2(tz-tol)4]Cu(tz-tol)2(N-metilimH)2 Cu(tz-tol)2(4-metilimH)2 [Cu2(tz-ben)4] Cu(tz-ben)2(imH)2 Cu(tz-ben)2(N-metilimH)2 [Cu2(tz-naf)4] Cu(tz-naf)2(N-metilimH)2 Cu(smtz)2&#61655;H2O [Cu(smtz)2(N-metilimH)2&#61655;H2O[Cu(smtz)2(imH)2]Cu(smtz)2(4-metilimH)2&#61655;3H2O[Cu(smtz)(1,2-dimetilimH)3(OH)]·½H2O Cu(smtzn)2&#61655;3H2O [Cu(smtzn)(imH)](NO3)&#61655;½H2OCu(smtzn)2(N-metilimH)2&#61655;2H2O[Cu(smtzn)(4-metilimH)](NO3)&#61655;H2O El estudio químico de caracterización de los complejos se ha realizado mediante las técnicas de análisis elemental, espectroscopía infrarroja (IR), espectroscopía electrónica, espectroscopía de resonancia paramagnética (RPE) y medidas magnéticas. Además se ha determinado la estructura cristalina de los compuestos [Mn(4-metilimH)2(OH2)4](smtz)2, &#61563;[Mn(smtzn)2(OH2)]·(imH)&#61565;n, [Cu(smtz)2(imH)2], [Cu(smtz)(1,2-dimetilimH)3(OH)]·½H2O, [Cu2(tz-tol)4] y [Cu2(tz-naf)4] El anión O2.-, producido como consecuencia del metabolismo celular, es mediador de enfermedades tan importantes como infarto agudo de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, apoptosis celular, cáncer, artritis o desórdenes neurológicos como las enfermedades de Parkinson o Alzheimer.Por ello, cabe suponer la existencia en la célula de ciertos mecanismos de defensa contra el daño provocado por la toxicidad de este radical. Entre estos mecanismos se encuentran los enzimas Superóxido Dismutasa (SOD), que catalizan la dismutación del superóxido (O2.-) para formar peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. Se conocen diferentes clases de enzimas SOD clasificados basándose en el metal que se encuentra en el centro activo del enzima y que participa en la catálisis. Así, encontramos los enzimas Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, Fe-SOD y más recientemente Ni-SOD.Actualmente existen ciertos complejos metálicos que se comportan mimetizando la actividad de este enzima. En el presente trabajo se ha ensayado la actividad SOD que presentan los complejos obtenidos mediante métodos in vitro indirectos (Oberley y Spitz) y se ha desarrollado un nuevo método in vivo basado en la protección que ejercen los complejos frente al estrés oxidativo en diferentes cepas de la levadura S. cerevisiae. (Cepa salvaje: W303-1ª, cepa mutada: ATCC 96687, carente del gen que expresa el enzima Cu/Zn-SOD). Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto que algunos de los complejos ensayados presentan actividad SOD ya que éstos han mejorado el crecimiento de la cepa de S. cerevisiae mutada carente de la Cu/Zn-SOD.A continuación se ha estudiado la actividad nucleasa de los complejos, consistente en la determinación de su capacidad para escindir la cadena helicoidal de ADN. El ADN es el material genético de los organismos celulares. La capacidad que poseen los complejos para escindir la doble hélice del ADN mediante procesos de oxidación-reducción actuando como nucleasas químicas resulta de gran interés en el campo de la medicina y la biotecnología por el uso potencial de estos complejos metálicos como agentes antitumorales. La capacidad nucleasa de los complejos se ha determinado mediante electroforesis en gel de agarosa.El ADN utilizado para los ensayos es plásmido pUC 18. Los plásmidos existen como moléculas cíclicas de ADN superenrollado. La rotura de una cadena hace que este estado superenrollado (forma I), se convierta en un estado simple cíclico relajado (forma II). Cuando se produce la rotura en la otra cadena de la doble hélice se obtiene la forma lineal del ADN (forma III). La forma I superenrollada migra más rápidamente que la forma II relajada. La forma III, lineal, migra en los geles de agarosa en una posición intermedia entre la formas I y la forma II.Se ha analizado el comportamiento electroforético, en geles de agarosa, del ADN tratado con los distintos complejos en diferentes tampones (TRIS-HCl, borato, cacodilato, etc.) y con diversos oxidantes y reductores (H2O2, ascorbato, oxone Na2S2O8, etc.). Se comprueba que son capaces de cortar el ADN y que son más activos como nucleasas que los metales que los forman. Mediante la técnica de AFM (Atomic Force Microscopy) se han confirmado los resultados obtenidos para el complejo Mn(smtzn)3·3H2O. Para algunos de los complejos se han realizado estudios de especificidad de corte al ADN, utilizando los enzimas de restricción EcoRI y Sca. Estos estudios han mostrado que los complejos ensayados no presentan corte especifico sobre el ADN. / The main objective of this doctoral thesis is the synthesis and characterization of metal complexes of Mn(II), Mn(III) and Cu(II) with N-substituted sulfonamides that present biological activity (SOD-like activity and nuclease activity). Five sulfonamides derivatives have been used for the synthesis of the complexes. The chemical characterization of the complexes has been carried out by elemental analysis, infrared spectroscopy, electronic resonance spectroscopy, electronic spectroscopy and magnetic measurements. Also, the crystal structures of the complexes [Mn(4-metilimH)2(OH2)4](smtz)2, &#61563;[Mn(smtzn)2(OH2)](ImH)&#61565;n, [Cu(smtz)2(imH)2], [Cu(smtz)(1,2-dimetilimH)3(OH)]·½H2O, [Cu2(tz-tol)4] and [Cu2(tz-naf)4&#61533; have been determined.The biological activity of the complexes as SOD mimics and as chemical nucleases has been assayed.The interest of complexes with SOD-like activity is due to their possible use in chemical therapy of diseases produced by free radicals generated in organism as subproducts of cellular metabolism. SOD-like activity of complexes has been tested by in vitro methods (Oberley and Spitz). Moreover, for determining this activity a new in vivo method based on the protection of the complexes against oxidative stress over diferent strains of S. cerevisae has been developed.The results obtained in vivo have shown that some of the complexes present SOD-like activity. They are able to improve the growth of the S. cerevisae mutant strain (&#916;sod1) which is defective in Cu/Zn-SOD.The capacity of complexes to cleave DNA acting as chemical nucleases has been studied too. This capacity is of great interest in medicine and biotecnology for the potencial use of these metal complexes as antitumoral agents. The nuclease activity has been determined by agarose gel electrophoresis. DNA was treated with the complexes in the presence of different reducting agents (H2O2, ascorbate, .) at different pH. The results have pointed out that some complexes are able to cleave supercoiled DNA to linear DNA.For the different complexes, specificity using restriction enzymes (EcoRI and Sca) and action mechanism have been investigated.